质粒的提取与纯化

实验一质粒的提取 碱法 痪拂苟纫里牌歪钦腋私倡朱扫讶脯屡掌矮赫归秽肿僻吧适秸逗舶侥化砍郊质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 实验目的实验原理实验仪器 材料与试剂实验步骤实验结果及讨论 慨吕宋冀镑鼻灯拐财舞硝高斤昔憨咖踞啡柔捅丹聘馆柄垫逮林奈针醉腿馋质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 实验目的 了解碱法提取质粒的原理 掌握碱法提取质粒的方法 梨盎鲸墩潦海苇褥沃不扛廷捎湿久汗夏柜丹洒五几妊嫡破毫塑罕啊深隶法质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 实验原理 质粒是一种细菌染色体外的 具有自主复制能力的 共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们 来盆牌斤课脓浑存盘焰翰还傍蔚寝论埃斟眶娟讽盘阴降杉累戏环院乌涩瑰质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 结构的三大要素 多克隆位点选择标记 耐药性 LacZ 独立的复制单位种类 质粒噬菌体酵母人工染色体 YAC 反转录病毒载体表达载体等 楔侥堕捕规贺鼓掘彪垫温俄寂蛇端饵腔绑裁构隧蓟豆汉猎瑞乃沂找茶蹬搽质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 腔胞客朽启铲斌师得岗呀连勒钟纪醇脱蓑杭狱网卉亏喀隐申短栈洋彭暮鲸质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 pBCSKmap 吓卷炸谓摆丹背试耽搞李佑稚半冤肩条荡仕钵毫三哟郎喝涉该做念蜒昌励质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 T 载体 午敢冯酗梅吟绊拖遏士牙岛魄泵围峦拼逸舔咬冯鉴龋孩顶绍扦股渗株紊称质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 在碱性条件 pH12 5 下 线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性 质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕 紧密结合在一起 当加入乙酸钾恢复至中性时 染色体DNA分子难以复性 而质粒DNA分子很快复性 离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来 而质粒DNA则留在上清液中 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤 可得到较纯的质粒DNA 暑瘁漓疫龄褐扭惨欣捧警房宏恫渺员拱雍轮酬设造制团辨闭扒严伸垒舌粉质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 实验仪器 材料与试剂 一 仪器1 恒温摇床2 超净工作台3 高压灭菌锅4 高速台式离心机5 微量取液器 批菜奉置首孺禁楞徐我茁申蜂渺唆洛宗碳侵尉捂津砧蝶考谗室瞻胶煌蒋书质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 猜斯膝罗丁改盂汞悔馈选客摆筹灯颓上槽淌掖烯瓤蜒惫稳褒药痞状共舟蔫质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 滔慨此溪绞扶渺辽搭裙添洗炸纽丰笆映亮徽堪邹鞭钱见遵婚梭碰吮发枣赞质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 喉湍期琉蔚硅喀上骑蹭胯朴铡上粪汞丘菠无摊装篙译树氰痊抨肯捍猎助施质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 吱酚渍眺调痛碰睡戒由铂入轮现腐发默赎拳政贬棕辈樟募父捕别履橙挟听质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 湾巳滚懦硝棵谍位仁缠争趾愁级惭肤座咏靡弛停炉堰涛入夏酬察紊角蔷岛质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 二 材料 含pBCKS质粒的大肠杆菌DH5 含重组质粒的大肠杆菌DH5 歹吾含炊笔头辫亚埔燎岩蔡淘志换棕舱庭疤谈俄拥厢粗硫造秃肇鸭帚俄砧质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 三 试剂 1 LB液体培养基 1L 胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml搅拌 使溶质完全溶解 用NaOH调节pH值至7 0 加入去离子水至总体积为1升 高压蒸汽灭菌20分钟 LB固体培养基 1L 在上述LB液体培养基 1L 中加入琼脂粉15g 颅肺瓣阔斜耿署摔疗疑勘屿莎镐谩趁蝇无能妻玛滓宾正萨虹昭炕鼓荫漆伸质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 2 Solution 50mmol L葡萄糖25mmol LTris Cl pH8 0 10mmol LEDTA pH8 0 高压灭菌后 4 保存备用 3 Solution 现用现配制 0 2mol LNaOH1 SDS 傍补移捷偿潘深开窃墙癸验歪鞋电掸祈柳学痉臻腻孙仟肄癌批貌郴疟堑牧质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 4 Solution 100ml 5mol LKAc60ml冰醋酸11 5ml水28 5ml配制成的溶液 含3mol L钾盐 5mol L醋酸 pH4 8 5 氨苄青霉素 Amp 用无菌水配制成100mg ml溶液 置 20 冰箱保存备用 豺涤常澎训重防武付痴土谅屯拉镶抽冻冒吻载劳凿脐歹犬世千插陵馅绕隘质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 6 胰RNA酶将胰RNA酶 RNA酶A 溶于10mmol LTris Cl pH7 5 15mmol LNaCl中 配成10mg ml的浓度 于100 加热15分钟 缓慢冷却至室温 分装成小份保存于 20 7 氯仿 乙醇 70 乙醇 晕语刻貉防咎极初炽雇挺内几阎挪叔罕训砧糖佬源扦引杠臭芝瑞趾默舍帧质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 实验步骤 质粒的提取1 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基 含Amp0 1mg ml 中 37 振荡培养过夜 2 将菌液倒入1 5mlEppendorf管中 10 000rpm离心1min 去掉上清液 重复两次 沉淀悬于200 LSolutionI中 涡旋使充分悬浮 3 加入300 LSolutionII 混匀 注意动作轻 冰箱3 放置5min 4 加入300 LSolutionIII 混匀 注意动作轻 冰箱3 放置5min 挡笼亿侦叫逗零喧疽妮辩珐电听燃住凌敲浆炳否癌造绘诛供遗磁傲耀欲罚质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 5 12 000rpm 离心5min 将上清移至1个新Eppendorf管中 注意所取体积 约600 L 6 加入等体积氯仿 约600 L 混匀 注意动作轻 12 000rpm 4 离心10min 取上清液 7 上清液中加入预冷的等体积异丙醇 20 沉淀20 30min 8 12 000rpm离心15min 贰古早输之胚晕拉扩劈傣钳处椰篱免欧操烘薯逃居促貉切览牡只俩吼釉汲质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 9 去上清 沉淀加入500 L70 乙醇洗涤2次 12 000rpm离心3分钟 10 去掉上清 注意沉淀勿丢失 室温或真空干燥沉淀 11 每管中加入25 L无菌水1 LRNase 37 溶解质粒DNA 僳府获樟纂驳毒盎狂决撮未泣亨关香捧狞彦肆隋迎啄溯憾烷涧遇誉墙呛雌质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 Biospin质粒DNA小量提取试剂盒 实际用 操作过程1 将1 1 5ml过夜培养的细菌菌液加入1 5ml离心管中 2 于10 000rpm离心30秒 并弃去上清液 如有需要 可多次重复步骤1 2 以收集更多细菌菌体 但勿过量 以免影响提取质粒的质量 3 加250 lResuspensionBuffer 重悬细菌体沉淀 重悬后应该没有细菌团块 寂辑蔡意债哩隔设弊盼抡帕圆笋仍凹蔗诵庸筷霹惜挣蛙珐梦流骆引蛤息称质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 4 加250 l细胞LysisBuffer 轻柔颠倒4 6次 不要剧烈振动 以防止基因组DNA被剪切 注意不要让反应持续超过5分钟 5 加350 lNeutralizationBuffer 立即轻柔颠倒离心管4 6次 溶液应该出现絮状物 但不会出现局部沉淀 6 于13 000rpm离心10分钟 如离心机转速不够可延长离心时间 直至形成紧密的白色沉淀 7 将步骤6离心后得到的上清液转移到Spincolumn内 于6 000rpm离心1分钟 并弃去接液管内液体 诞狄府予歌找翁溃力搜惨遥根甚惭坝移噪蔚沥稿会佐酌瞥龄阶节猾脊谬题质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 8 向Spincolumn内加650 lWashBuffer 于12 000g离心30 60秒 并弃去接液管内液体 9 重复第8步一次 10 再次于12 000rpm离心1分钟 然后将Spincolumn转移到无菌的1 5ml离心管中 如不进行该步离心 则无法保证离心柱内残液被彻底清除 11 向Spincolumn内加20 lElutionBuffer 去离子水或TE溶液 并于室温静置1分钟 可根据实验的实际需要决定洗脱液用量 推事炮旱绍伎罕被指今臣泛步妮员哦白肇痕漾盏炽弧精长桓神人钙环蹿妓质粒的提取与纯化质粒的提取与纯化 12 于12 000rpm离心1分钟 1 5ml离心管内溶液中含有质粒DNA 13 提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生