TCID50计算.doc

病毒TCID50测定（组织半数感染量）操作步骤(1) 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传800010000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。(2) 稀释待测病毒液。A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-210-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】37CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续在37 CO2培养箱中培养。(4) 培养将培养板放置于CO2培养箱。培养温度 ，培养 天。(5) 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。计算方法1) Spearman-Karber 法 LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + dR1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数 d = 稀释因数对数 N1 = 每个稀释度所种的孔数 R1 = 病变孔数 = 积和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.72) Reed-Muench法观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-410-5之间，其中间距离比例按Reed和Muench公式计算：TCID50高于50%病变的病毒最高稀释度的对数距离比例故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4.5，即TCID50为104.5倍，当病毒悬液做104.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100 TCID50/0.1ml。3) 判定标准细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。1.病毒滴度的测定（组织细胞半数感染量TCID50滴定）1）流感病毒的制备利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝试验测定病毒的存在，分装后-70冻存。2）病毒的稀释取1管冻存病毒尿囊液，1：100稀释。第一排孔加入146l 1：100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成为102、102.5、103、103.5107。每孔含有100l病毒液，每个稀释度重复4孔。人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入2g/mlTPCK-胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在条件下即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液，以获得最佳结果。3）MDCK细胞的准备使用前2天将MDCK细胞1：10传代，使之7090%成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于30代）将使细胞对病毒的敏感性降低。弃去细胞培养液，用5毫升EDTA-胰酶洗细胞一次，然后弃去。加4至5毫升EDTA-胰酶覆盖细胞（162cm2的细胞培养瓶）37，5%CO2温箱中消化1020分钟。待细胞开始脱落时，加入510毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入离心管，2000转离心5分钟，用PBS洗涤2次，以除去牛血清。将细胞悬浮于1毫升病毒稀释液中，用吸管充分吹打分散细胞，再加病毒稀释液至10毫升。在细胞计数板上计数细胞是数量。用病毒稀释液将细胞稀释成1.5105细胞/毫升加100l细胞（1.5x104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。在37，5%CO2孵箱中培养1820小时。病毒TCID50滴度的计算：组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒的稀释度，一般使用Reed-Muench方法计算，详细过程见表稀释度阳性数目（1）阴性数目（2）阳性数（3）阴性数（4）比率（5）阳性数百分比（6）1044011011/11100104.540707/710010531313/475105.504050/501计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）2计算阳性和阴性孔的累积数阳性孔累计数由下向上累积（3）；阴性孔累积由上向下累积（4）3计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/(3)+（4）；(6)=（5）1004计算距离比距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性比-小于50%的阳性百分比）=（75-50）/（75-0）=0.3TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例x稀释系数的对数 =5+0.30.5=5.15TC