单克隆抗体与肿瘤的导向治疗

单克隆抗体与肿瘤的导向治疗,冯冰虹教授,一、单克隆抗体1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（ ）球蛋白和丙种（ ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。,第一节 概述,1975年：Khler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。1984年：人-鼠嵌合抗体1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。,1984年诺贝尔奖,第二节 单克隆抗体,一、单克隆抗体的产生基础：融合细胞的 制备,诱导细胞融合的主要方法,1. 病毒诱导融合2. 化学融合剂诱导融合 其中最常用的是聚已二醇（PEG）3. 电融合,病毒诱导融合,脂质体诱导融合,电融合,是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。,单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的与单一抗原决定簇结合的抗体。,二、单克隆抗体技术的原理,Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58,1,2,3,4,1,2,3,4,单克隆抗体,细胞融合,取出脾细胞,+癌细胞,x,传统抗血清（多克隆抗体）,抗原,免疫,1,2,3,4,B细胞,制备过程（图示）,多克隆抗体鼠源单克隆抗体人-鼠嵌合抗体人源化抗体全人源抗体,三、人源性单克隆抗体的制备,血清半衰期短，20h抗原抗体结合力、亲和力不够募集效应细胞产生副作用HAMA反应：810天出现，2030天高峰, 加速单抗清除。过敏休克,（一）鼠源单抗临床应用的障碍,鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体，叫做人抗鼠抗体（HAMA）反应。HAMA反应对鼠源的单抗分子有着较强的破坏作用，严重影响了鼠源单抗在人体内的功效，所以非常有必要改进鼠源单抗。,HAMA反应Human Anti-Mouse Antibodies,EB 病毒转化技术细胞工程单克隆抗体技术1 人-鼠杂交瘤单克隆抗体2 人-人杂交瘤单克隆抗体3 EB 病毒转化-融合技术4 转基因动物制备单克隆抗体5 重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体人单抗制备技术的发展（新基因工程技术）,（二）人源性单克隆抗体的制备,EB病毒（epstein-barr virus,EBv）是epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名。EB病毒的形态与其他疱疹病毒相似 。EB病毒仅能在B淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代。,EB 病毒转化技术,EB病毒转化淋巴细胞,1. 人-鼠杂交瘤单克隆抗体人脾细胞鼠骨髓瘤细胞,细胞工程单克隆抗体技术,人脾细胞人骨髓瘤细胞细胞种类少,2. 人-人杂交瘤单克隆抗体,利用EB病毒转化B淋巴细胞为永生细胞 与鼠骨髓瘤细胞融合,3.EB 病毒转化-融合技术,人抗体基因(除CDR)导入小鼠胚胎转基因小鼠抗原免疫标准杂交瘤方法,4. 转基因动物制备单克隆抗体,转入人的Ig基因组,免疫动物,人抗体,基因敲除小鼠,将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,SCID: severe combined immunodeficiency mouse 既无有功能的T细胞也无B细胞的小鼠,对异源移植物不产生任何排斥反应,可以作为良好的载体系统用于医学及生物学各个领域的研究,但极易感染病菌,饲养和操作管理十分复杂。,5. 重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体,SCID,将人淋巴细胞移植到体内,将人淋巴细胞移植到小鼠体内抗原免疫标准杂交瘤方法或制备抗体库,重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体,T淋巴细胞功能缺陷1962年偶然发现有个别无毛小鼠， 后来证实是由于基因突变造成的并伴有先天性胸腺发育不良，称为裸小鼠(nude mice)，用“nu”表示裸基因符号。裸小鼠是由于染色体上等位基因(第11对染色体上)突变引起的，已失去正常胸腺。,裸 鼠,裸小鼠的主要特征表现为无毛(hair less)和无胸腺(athymus)。随着鼠龄增加皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。由于无胸腺,仅有胸腺残迹或异常上皮,这种上皮不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴细胞正常，但功能欠正常,特 性,饲 养,1.概念： 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括 嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。,人单抗制备技术的发展（基因工程） (Genetic engineering antibody),人-鼠嵌合抗体改型抗体组合抗体库技术与噬菌体抗体文库技术表位印模选择技术,2. 基因工程制备抗体技术,CDR移植,人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。,利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列制备的人源化抗体称为：,A: 人-鼠嵌合抗体B: 改型抗体 C: 组合抗体D: 表位印模选择抗体,3. 各种基因工程抗体特点（1）嵌合抗体(chimeric antibody) 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,（2） 单链抗体(single chain antibody) 用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。 特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。,单链抗体的应用：（1）用于肿瘤的导向治疗（2）肿瘤的影像分布（3）基因治疗 细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物的抗体，可干扰该基因产物的生物活性。（4）研究基因结构与功能的关系,（3） 人源化抗体(humanized antibody)（1） 将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。（2）将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,（4） 双价抗体与双特异性抗体 (bispecific antibody) 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。 将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。,一、用作诊断试剂 1. 检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2. 鉴定病原体，准确诊断传染病。 3. 用于肿瘤的诊断和分型。 4. 激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态。,第三节 单克隆抗体在医学上的应用,二、用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子的功能三、用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗,生物导弹,“生物导弹”单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌