膜片钳patch-clamp

一 离子通道概论 离子通道 ionchannels 是细胞膜中的跨膜蛋白质分子 对某些离子能选择通透 其功能是细胞生物电活动的基础 膜片钳技术应用于通道离子电流的记录 膜片钳是Neher和Sakmann于1976年建立 它利用一个玻璃微电极同时完成膜片 或全细胞 电位的钳制和膜电流的记录 1991年 膜片钳技术的创始人Neher和Sakmann荣获诺贝尔生物学奖 离子通道按激活方式分为两类 1 电压门控离子通道 voltagegatedchannels 即膜电压变化激活的离子通道 通道开 关一方面是与膜电位有关 voltage dependent 另一方面与电位变化的时间有关 time dependent 按通过的离子命名 如钠通道 钙通道 钾通道和氯通道四大类 2 化学门控离子通道 ligandgatedchannels 由递质与通道蛋白分子上的结合位点相结合而开启 按递质或受体命名 二 离子通道的分类 配体门控性离子通道 也称作受体型离子通道存在于快反应细胞膜上 由单一肽链反复4次穿透细胞膜形成1个亚单位 约4 5个这样的亚单位组成跨膜离子通道 受体激动时离子通道开放使细胞膜去极化或超极化 产生兴奋或抑制效应 N型乙酰胆碱 氨基丁酸 GABA 受体等 一 钠通道钠通道 sodiumchannels 是选择性允许Na 跨膜通过的离子通道 目前对钠通道特征 门控动力学及生理意义研究得比较清楚 钠通道均为电压门控离子通道 主要功能是维持细胞膜兴奋性及其传导 因而心肌细胞动作电位 actionpotential AP 的上升相取决于钠通道 即0期 现已克隆出9种人类钠通道基因 钠通道的分类根据对钠通道阻滞剂TTX和 conotoxin CTX 的敏感性不同分为3类 1 神经类钠通道 对TTX敏感性高 而对 CTX敏感性低 2 骨骼肌类钠通道 对TTX和 CTX敏感性均高 3 心肌类钠通道 对TTX和 CTX敏感性均低 心肌钠通道 激活所需要的电压高 失活速度快 引起动作电位 actionpotential AP 的0期去极化 离子电流以正离子流动的方向确定离子流方向 正离子内流 引起膜去极化 外流 膜产生超极化 二 钙通道 钙通道 calciumchannels 在正常情况下为细胞外Ca2 Ca2 o 内流的离子通道 它存在于机体各种组织细胞 是调节细胞内Ca2 Ca2 i 浓度的主要途径 1 电压门控钙通道 voltage gatedCa2 channels 目前已克隆出L N T P Q和R6种亚型的电压依赖性钙通道 这类通道存在于细胞器如肌质网 sarcoplasmicreticulum SR 和内质网 endoplasmicreticulum ER 膜上 是储钙释放进入胞浆的途径 由于三磷酸肌醇 inositoltriphosphate IP3 或Ca2 等第二信使激活细胞器上相应受体而引起通道开放 故称为细胞内受体门控离子通道 当细胞膜去极化时 电压门控钙通道开放 Ca2 内流使细胞内Ca2 突然增加而触发Ca2 释放 从而引起细胞兴奋 收缩耦联等生理活动 这一过程称为Ca2 诱发Ca2 释放 2 受体调控性钙通道 receptor operatedCa2 channels 三 钾通道 钾通道 potassiumchannel 是选择性允许K 跨膜通过的离子通道 是目前发现的亚型最多 作用最复杂的一类离子通道 广泛分布于骨骼肌 神经 心脏 血管 气管 胃肠道 血液及腺体等细胞 自1987年成功地克隆出第一个钾通道基因后 现已克隆出几十种亚型 其中 钾通道在调节细胞的膜电位和兴奋性以及平滑肌舒缩活性中起重要作用 钾通道按其电生理特性不同分为电压依赖性钾通道 钙依赖性钾通道及内向整流钾通道 1 电压依赖性钾通道 voltage dependentK channels 1 延迟整流钾通道 delayedrectifierK channels 此类通道称为Kv通道 其电流为Ik Kv通道共有9个亚型 Kv1 Kv2 Kv3 Kv9 Kv通道在去极化时激活而产生外向电流 这类通道广泛分布于各种组织细胞 与膜的复极化有关 在心肌细胞 存在两种主要的延迟整流钾通道 它们参与心肌细胞动作电位的复极化过程 其电流为Iks Ikr 根据其激活动力学 Iks为慢激活整流钾电流 其激活时间大于3s Ikr为快激活整流钾电流 激活时间仅150ms Iks Ikr为心肌细胞动作电位复极3期的主要离子流 类抗心律失常药物选择性阻滞Ikr 使动作电位时程延长 2 瞬时外向钾通道 transientoutwardK channels 此类钾通道被称为KA通道 其电流为IA或Ito KA通道在去极化明显时才能激活 其产生外向电流无整流特性 参与动作电位1期的复极过程 该通道激活迅速 失活快 Ito可分为对4 氨基吡啶 4 AP 敏感的钾电流Ito1 以及对钙敏感的Ito2 实为钙依赖性氯电流 Ito1可被4 AP阻滞 Ito2可被ryanodine阻滞 3 起博电流 pacemakerchannels If If是非特异性阳离子电流 即由一种以上单价阳离子 如K 和Na 共同携带的离子电流 是窦房结 房室结和希浦系统的起搏电流之一 If电生理特性 If是由膜超极化激活的随时间而逐渐增加的内向电流 其阈电位在 50 70mV左右 If对Cs 敏感 0 5mMCs 几乎将If完全阻滞 肾上腺素 Adr 促进If的激活 If电流增加 这是交感神经刺激加快心率的离子基础之一 If受乙酰胆碱 Ach 的调节 Ach可抑制If 使心率减慢 故一般认为副交感神经或迷走神经减慢心率的机制是因为Ach抑制If的结果 Ach的作用与Adr正相反 此类钾通道为KCa 其电流为Ik Ca ICa是一类具有电压和Ca2 依赖性的钾通道 去极化和提高 Ca2 i浓度均可激活而使其开放 K 外流使膜复极化或超极化 分布于血管平滑肌 直接参与血管张力的调节 具有较大的生理意义 该通道开放时 K 外流使膜复极化或超极化 同时引起血管扩张 因此当血管平滑肌细胞去极化和Ca2 进入细胞时 KCa将起到负反馈调节作用 2 钙依赖性钾通道 Ca2 dependentK channels 3 内向整流钾通道 inwardrectifierK channels 这类钾通道都具有内向整流特性 其中比较重要的有三种 内向整流钾通道 KIR ATP敏感的钾通道 KATP 及乙酰胆碱激活的钾通道 KAch 1 内向整流钾通道 inwardrectifierK channels 该通道在心肌细胞称为KIR Kir2 1 其电流为Ik1 在心肌细胞 心室肌 KIR通道也参与AP的3相复极 但主要维持4相静息电位 防止由于Na K 泵的作用使膜超极化大于钾平衡电位 EK 该通道被称为KATP Kir6 2 通道 其电流为IK ATP KATP为代谢性调节K 外流通道 KATP通道激活和失活受细胞内ATP ADP的比率影响 在正常生理情况下 该通道处在失活状态 只有在缺氧 能量耗竭及ATP减少时 通道才逐渐被激活而开放 阻滞剂为格列本脲 glibenclamide 和甲苯磺丁脲 tolbutamide 等 通常所称的钾通道开放剂就是指激活KATP通道的药物 代表药物有吡那地尔 pinacidil 等 2 ATP敏感的钾通道 ATP sensitiveK channels 3 乙酰胆碱激活的钾通道 acetylcholine activatedK channels 该类通道称为KAch Kir3 通道 其电流为Ik Ach 它存在于心脏的窦房结 房室结和心房肌细胞 主要由Ach和GTP激活 亦可被超极化激活 Ach作用于M受体而激活此通道 增加舒张电位而导致负性频率作用 Ach的浓度升高增加其开放概率 三 离子通道的分子结构及门控机制 1 电压门控离子通道的分子结构钠 钙和钾电压门控通道在分子结构上有许多相似之处 离子通道蛋白是多亚基 subunits 构成的复合体 其中 构成孔道部分的是 亚基 各种电压依赖的离子通道的 亚基均在膜上形成四个跨膜区 D1 D4 钠 钙通道的四个跨膜区由共价键连接成四倍体位于同一肽链 整个亚基只有一个N 末端和一个C 末端 钾通道的 亚基只有一个跨膜区 功能性钾通道是四个 亚基由非共价键连接而成的四聚体 每个跨膜区由6个呈 螺旋式的跨膜片段 transmembranesegmants S1 S6 及其间的连结肽链所组成 连接S5 S6的肽链部分贯穿于膜内 是形成亲水性孔道而有选择性地让离子通过的部分 称为孔道区 poreregion 或P区 另一个重要的肽段是S4 S4共带4 8个正电荷 当膜电位变化时 S4螺旋构型即发生变化 通道开放 故S4被称为电压门控性离子通道的电压感受器 voltagesensor 2 内向整流钾通道的分子结构 具有内向整流性钾通道 主要指KIR KACh KATP等 他们与Kv通道一样由4个 亚单位对称排列而成 但每个 亚单位只有2个跨膜螺旋片段 M1和M2 两者由H5连接 3 离子通道的门控机制 电压依赖性钠通道受膜电位的影响 在不同电压影响下 通道蛋白发生构象变化而使通道不断转换于静息态 restingstate 开放状态 openstate 和失活状态 inactivestate 通道内侧有m激活闸门和h失活闸门来控制通道的开启和关闭 静息时 m门位于通道内 使通道处于关闭状态 即静息态 兴奋时 在去极化作用下 m闸门激活而移出通道外 使通道开放 Na 内流 即为激活态 但在去极化作用下 原来