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CRISPR-Cas9技术在基因组高通量研究中的进展CRISPR-Cas9作为以RNA为导向、通过Cas9核酸酶发挥DNA剪切作用的基因编辑技术，目前已成功作为一种工具，可对人类细胞进行高效、特异性的遗传学改造。CRISPR-Cas9技术是在DNA水平上对靶基因进行敲除，因此避免了siRNA干扰不彻底、持续时间短的弊端，且相比于另外两种基因敲除技术TALEN和ZFN，其操作简易、成本低，因此该项技术越来越受到科研领域的关注，逐渐成为了研究者在进行基因敲除中的首选技术。CRISPR-Cas9技术在基因功能确证以及疾病模型的构建中发挥着重要的作用1, 2，凭借该项技术除了可对单一基因进行遗传操作外，通过建立sgRNAs（single guide RNAs）基因组文库，其在全基因组高通量筛选中更是发挥着不可替代的作用3。CRISPR-Cas9在全基因组筛选中，不仅可以靶向蛋白质编码区域，还可以靶向基因调控区域；不仅可以靶向DNA，还可以靶向microRNA、lncRNA等RNA序列4；不仅可以进行功能缺失性（loss-of-function）研究，还可以进行功能获得性（gain-of-function）研究，这是目前任何一种其他技术不具备的优势，下面将依据功能缺失性研究和功能获得性研究分类对CRISPR-Cas9在基因组高通量研究中的进展进行简单介绍。功能缺失性研究：在早期的CRISPR-Cas9全基因组筛选中，研究者们通过正向选择（positive selection） 和负向选择（negative selection）筛选到很多已知的（known）和新发现的（novel）对肿瘤发生、发展相关基因、功能必需基因以及药物、毒物耐受基因。在正向选择中，通过外界施加选择压力，将那些由于基因缺失丧失生存优势的群体淘汰掉，最后检测存活下来的群体中缺失的基因，即为参与药物、毒物耐受的基因。Zhou Y等研究者通过CRISPR-Cas9高通量筛选明确了耐受炭疽毒素的必需基因5； Feng Zhang等研究者在黑色素细胞中，寻找到功能缺失导致BRAF抑制剂vemurafenib耐药的重要基因，这些基因中包括已知的NF1 、MED12，也包括新发现的候选基因NF2、CUL3、TADA2B和 TADA16。关于负向选择，其目的是寻找到那些由于缺失而在群体中消失的基因，即为存活必需基因。最为简单的negative selection例子则是将CRISPR-Cas9基因组文库转染入靶细胞中，经过长时间细胞培养，被淘汰掉的细胞丧失的基因即为存活必需基因6。负向选择另一重要的应用是明确肿瘤细胞的癌基因，从而寻找到新的候选药物靶标（drug target）7.功能获得性研究：功能缺失性研究可以通过siRNA文库、shRNA文库以及新兴的CRISPR-Cas9技术来实现，但是在CRISPR-Cas9技术出现之前，功能获得性研究仅能够通过cDNA过表达文库来实现8。并且cDNA文库受到 cDNA大片段克隆或表达方面的限制，覆盖率不是很高，且无法兼顾转录异构体的复杂性，由于其表达不依赖于內源性固有的调控机制，常常会导致人造的（artificial）的假象。研究者通过将dCas9（catalytically inactive Cas9，催化活性丧失的Cas9）或sgRNAs与不同的转录激活因子9、转录抑制因子10或招募蛋白结合，可原位定点（targeted loci）调控基因的表达且不改变基因组的序列。Feng Zhang等研究者近期通过研究Cas9、guide RNA和ssDNA的三维晶体结构，设计出由dCas9融合蛋白和修饰的sgRNA共同组成的Cas9基因激活复合物，且通过该系统在基因组功能获得性筛选中成功寻找到了由于上调赋予黑色素瘤细胞vemurafenib耐药性的候选基因11。CRISPR-Cas9高通量筛选技术凭借其方便、可控的操作平台和多样化的筛选形式，将会对生命科学和药物研发领域起到重要的推动、促进作用。参考文献1.Sanchez-Rivera FJ, Jacks T. Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology. Nature reviews Cancer. 2015; 15(7): 387-95.2.Dow LE. Modeling Disease In Vivo With CRISPR/Cas9. Trends in molecular medicine. 2015; 21(10): 609-21.3.Shalem O, Sanjana NE, Zhang F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature reviews Genetics. 2015; 16(5): 299-311.4.Heckl D, Charpentier E. Toward Whole-Transcriptome Editing with CRISPR-Cas9. Molecular cell. 2015; 58(4): 560-2.5.Zhou Y, Zhu S, Cai C, Yuan P, Li C, Huang Y, et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 2014; 509(7501): 487-91.6.Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen TS, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science (New York, NY). 2014; 343(6166): 84-7.7.Cheung HW, Cowley GS, Weir BA, Boehm JS, Rusin S, Scott JA, et al. Systematic investigation of genetic vulnerabilities across cancer cell lines reveals lineage-specific dependencies in ovarian cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011; 108(30): 12372-7.8.Yang X, Boehm JS, Yang X, Salehi-Ashtiani K, Hao T, Shen Y, et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods. 2011; 8(8): 659-61.9.Perez-Pinera P, Kocak DD, Vockley CM, Adler AF, Kabadi AM, Polstein LR, et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. 2013; 10(10): 973-6.10.Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nature protocols. 2013; 8(11): 2180-96.11.Konermann S