真菌萌芽

四川省人民医院 乔宁,EVIDENCE,真菌感染与实验室诊断进展,真菌感染日趋增加, 患者年龄的增高 广谱抗生素的应用 更多、更复杂的医疗手段（如移植等） 高强度细胞毒性治疗的应用 免疫抑制剂的应用 其它病因死亡率相对降低,真菌是院内感染常见微生物,占院内感染的-7.5%血液感染的-第四位肿瘤病人发病率-为8%严重创伤、烧伤病人-高达16%死亡率高-达55%70%,真菌感染的流行病学概况,真菌感染的第一个变化：深部真菌感染上升，其中曲霉菌感染明显上升； 近20年真菌感染的第二个变化：白色假丝酵母菌比例减少，其他念珠菌的比例上升。 曲霉菌引起全身感染的病例已不罕见，死亡率增加。,真菌感染的危险因素,基础疾病广谱抗生素使用静脉插管及各种侵袭性操作肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、放射性或化学治疗后、器官移植后高龄（65岁）、婴幼儿住院时间长，尤其是入住ICU大于5天以上,真菌概述,浅部真菌,深部真菌,双相型真菌,真菌感染的分类,根据真菌侵犯人体的部位分为四类：浅表真菌病皮肤真菌病 皮下组织真菌病系统性真菌病,浅部真菌病,深部真菌病,临床常见的真菌病,浅表真菌病花斑癣掌黑癣毛结节菌病,皮肤真菌病皮肤癣菌病 手足、体股、头、甲皮肤念珠菌病,皮下真菌病孢子丝菌病着色芽生菌病暗色丝孢霉病足菌肿,系统性真菌病念珠菌病曲霉病隐球菌病接合菌病双相真菌感染,浅部真菌病,限于皮肤最外层，甲板、毛发和粘膜的感染。主要的感染是皮肤癣菌病和浅表念珠菌病。大多轻微，容易诊断，对治疗反应良好。,手、足、甲癣最常见的真菌病,各种头癣：传染、危害健康,皮下真菌病往往经过外伤发病,孢子丝菌病,着色芽生菌病,系统性真菌病,常起源于肺，可以播散到全身许多器官,严重的可引 起死亡。常通过吸入致病菌孢子而获得，其致病菌腐生于土壤或腐败有机物中，或作为植物致病菌。病原体可分为两组：真正的致病菌和条件致病菌。,系统性真菌病危及生命,系统性真菌病主要的致病真菌,荚膜组织胞浆菌粗球孢子菌皮炎芽生菌巴西副球孢子菌,临床常见的条件性真菌感染,念珠菌病: 最常见，血源感染的第4位。曲霉菌病: 常见于干细胞移植、实体器官移植、大剂量化疗患者。隐球菌病: 艾滋病人患病率为10-20%。 接合菌病（毛霉病）:多见于重症糖尿病、烧伤病及器官移植病人。,临床有增多趋势的条件致病性真菌,非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染镰刀菌感染枝顶孢霉感染暗色真菌感染马尔尼菲青霉,真菌感染的诊断方法,真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学,真菌镜检,革兰染色 各种真菌均染成革兰阳性 直接镜检 氢氧化钾（KOH）标本墨汁标本 隐球菌其它染色(糖原染色、镀银染色、乳酸酚棉蓝染色等)，组织病理学,真菌直接镜检的操作,1.采集标本于载玻片上，滴加10%KOH一滴2.覆上盖玻片并微加热，略加压制片后作镜检3.查见真菌的有形成分（菌丝、孢子）即为阳性，反之，则为阴性,真菌直接涂片的诊断价值,最重要又基本的检测方法，一般医院都能开展，能为临床提供及时的诊断依据。发现真菌的有形成分如菌丝、假菌丝或较多的孢子往往提示真菌感染。根据菌丝、孢子的形态，部分可确定病原菌隐球菌：墨汁涂片中可见厚而透亮的荚膜念珠菌：假菌丝及芽孢马拉色菌：粗短如香蕉状的菌丝和圆形的孢子毛霉菌：粗大而不分隔的菌丝,念珠菌病-直接镜检,隐球菌病直接镜检,新 型 隐 球 菌,组织病理学,阿申蓝染色,H&E,PAS,组织学特点,Immunochemistry,皮肤隐球菌病的组织病理学,菌丝 孢子曲霉病的组织病理学,Prof. Richardd Calderones lecture-2006, Beijing,曲霉病,曲霉头,双分支菌丝,曲霉病直接镜检,双分支菌丝,曲霉头,接合菌（毛霉）病直接镜检,粗大无分隔菌丝,真菌的培养,培养特性： 营养要求不高，在 沙 保（Sabouraud）培养基上， PH46生长良好，需氧。浅部真菌： 2228，生长缓慢，大多于12 周出现典型菌落。深部感染真菌：37长的最好，生长较快，34 天即长出菌落。,真菌各种培养法,常用真菌培养基及用途,真菌的鉴定,方法：生化反应:用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。芽管形成厚膜孢子生成免疫学及分子生物学试验镜检:丝状真菌,常见病原真菌,酵母及酵母样真菌_念珠菌_隐球菌_毛孢子菌_马拉色菌等,霉菌(丝状真菌)_皮肤癣菌_曲霉菌_毛霉菌_镰刀菌等,双相真菌,念珠菌-实验室检查,直接镜检：可见卵园形发芽孢子及菌丝，如查到大量假菌丝，说明念珠菌处于致病状态。染色：革兰染色，菌丝、芽孢呈蓝色，着色不均匀。过碘酸染色，菌丝、芽孢染成红色。用1:1000吖啶橙染色，在荧光显微镜下，菌体呈现荧光。培养：最常用的培养基是沙保氏培基，当菌落生长后再移种至米粉吐温80培基或其它鉴定培养基中，以便进一步鉴定菌种。,芽管试验（Germ-tube test）,原理：白念珠菌在有营养的液体环境中35培养，可从酵母细胞生出芽管。结果：白念珠菌可在2h内生成芽管，热带念珠菌和其他念珠菌则否。,厚膜孢子形成试验（Dalmo plate test）,念珠菌显色培养基CHROMagar Candida,APIAUX酵母鉴定系统,ID32C 酵母鉴定系统,隐球菌(Cryptococcus),土壤、鸟粪、尤其是鸽粪中大量存在，它是机会致病菌。本属的共同特征为细胞呈圆形或卵圆形，偶有伸长形或多样形，呈多边芽殖。大部分菌株有荚膜。通过呼吸道进入体内健康人具有免疫能力 易感因素AIDS、糖尿病、淋巴瘤、肿瘤、SLE、器官移植,隐球菌病cryptococcosis,实验室检查-病原学检查,直接镜检: 墨汁染色，新生隐球菌呈圆形的双层厚壁孢子, 外有一层宽阔荚膜, 边缘清楚完整, 菌体内可见出芽（菌体计数：判断预后及疗效的指标）培养：培养基内可加氯霉素, 但不可加放线菌酮, 因后者抑制本菌生长。生理生化测定：采用自动微生物系统和API鉴定组织病理学检查及免疫组化,直接镜检,脑脊液直接墨汁涂片,真菌培养,SDA培养基，25培养,实验室检查-其它检查方法,乳胶凝集试验,阴性,阳性,隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验,标本为脑脊液或血清操作简便、快速，可用于隐球菌感染的早期诊断灵敏度和特异性均在95%以上，且有估计预后和疗效的作用。,隐球菌敏感药物,两性霉素B5-氟胞嘧啶 (与两性霉素B联合用药)氟康唑,曲霉菌-分类,烟曲霉是最常见的致病曲霉其次为黄曲霉和黑曲霉棒曲霉、灰绿曲霉、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉、杂色曲霉也有致病报道，但发生率低。,1、烟曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，棉花样，开始为白色，23天后转为绿色，数日后变为深绿色，呈粉末状。分生孢子头的顶囊烧瓶状，小梗单层，排列成木栅状，布满顶囊表面3/4，顶端有链形分生孢子，分生孢子球形，有小棘，绿色。,2、黄曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，黄色，表面粉末状。分生孢子头顶囊球形或近球形，小梗双层，第一层长，布满顶囊表面，呈放射状排列，黄色，顶端有链形孢子,3、土曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，小，圆形，淡褐色或褐色。分生孢子头的顶囊半球形，小梗双层，第一层短，第二层长，呈放射状排列，分布顶囊表面2/3，顶端有链形孢子 。,4、黑曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长快，表面黑色，粉末状。分生孢子头的顶囊球形或近球形，小梗双层，第一层粗大，第二层短小，呈放射状排列，布满整个顶囊，黑色，顶端有链形孢子 。,5、杂色曲霉菌,在SDA培养基上菌落生长慢，菌落圆形紧密，绒毛状，羊毛状，颜色有数环，从青绿到红绿。分生孢子头的顶囊近球形，小梗双层，第一层长，第二层短，呈放射状排列，布满顶囊4/5，顶端有链形孢子,6、构巢曲霉菌,在SDA培养基上菌落暗绿色，中央呈粉末状，边缘绒毛状。分生孢子头的顶囊半球形，小梗双层，第一层短，第二层长，呈放射状排列，布顶囊1/2，顶端有链形孢子。,曲霉菌的主要形态特征,菌丝-分隔、分枝、无色/淡色/深色足细胞-有分生孢子梗-分隔/不分隔,光滑/不光滑顶囊-烧瓶/半球产孢结构瓶梗/瓶梗+梗基分生孢子大小、颜色、纹饰其它:子囊果、菌核等,毛霉病(mucormycosis)概述,是由毛霉目中某些菌种引起人类一种感染性疾病, 一般呈急性快速发展, 少数为慢性发展。可累及鼻、脑、肺、胃肠道、皮肤等器官，其共同特征是血管壁破坏，血栓形成，周围组织梗塞，产生黑色坏死性损害。大部分病人有严重的基础疾病, 如糖尿病、免疫抑制、饥饿、烧伤或其它严重的外伤。,诊 断,较困难, 特别是内脏器官感染, 常常是在尸检中发现。 毛霉为空气的污染菌, 血、尿、脑脊液中罕见病原体生长, 血清学试验和直接ELISA 试验缺乏特异性。 直接镜检标本中和组织病理切片中见到宽大无分隔或极少分隔菌丝, 比培养分离更有意义。真菌镜检阴性, 不能除外诊断。 糖尿病患者, 有急性快速播散的鼻窦炎、眶组织蜂窝织炎、支气管炎、支气管或叶的肺炎, 应考虑毛霉病的诊断。,毛霉菌的形态,直接镜检,可见粗大的、无分隔的、不规则、宽约3-18um、分枝较少且呈直角的菌丝在HE染色清晰,PAS和GMS染色不良发现菌丝是诊断的基础,毛霉菌的培养,毛霉目中的致病菌在许多真菌培养基上快速生长对放线菌酮敏感，故培养基内不用此药，可加抗生素抑制细菌生长。活体标本不要研磨以免损坏菌丝，而妨碍生长。置于2530培养，根据镜下特征鉴定菌种。,双相型真菌,37 C 酵母相,27 C 菌丝相,定义,专指那些在组织内或37培养时呈酵母相，于室温中培养时则呈菌丝相的致病真菌包括申克孢子丝菌、马内菲青霉菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌和皮炎芽生菌等有较严格的地域分布（仅申克孢子丝菌此点不突出）对人体致病力较强（有较大的侵袭性），患者不一定在感染前有免疫受损,马内菲青霉（Penicilium marneffei）,属于双相型真菌 可引起马内菲青霉病（penicilliosis marneffei） 主要流行区为东南亚，如泰国北部、越南、香港、台湾及中国的南方 目前已成为HIV阳性患者的主要条件致病菌,青霉菌菌落特征,菌丝相,酵母相,在SDA或PDA上，25培养，生长快，初为白色膜样或绒状，逐渐变为黄色至黄绿色绒状，2周后呈灰绿色粉状，能产生可溶性酒红色色素，培养基呈红色（霉菌相）,青霉菌菌落特征,37在SDA上培养3天（酵母相）,显微镜特征-菌丝相,帚状枝分散，双轮生，少数为单轮生，对称或不对称，有27个梗基，梗基上有36个瓶梗，顶端变窄，也可见单个瓶梗 分生孢子呈椭圆形、球形，长而散乱，不成束,显微镜特征酵母相,可见关节孢子，圆形、椭圆形及两端钝圆有横隔的长形酵母细胞,非培养诊断的方法简介,真菌细胞壁成分 （1-3）- D-葡聚糖检测（G试验） 真菌抗原检查 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）真菌特异的代谢产物（D-阿拉伯糖醇）真菌DNA的检测,镜检和培养方法,敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植 和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难,非培养方法优点, 快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检测标 志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,深部真菌感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版,宿主因素 临床特征 病原学真菌镜检真菌培养组织病理学检查血清学检查方法（间接证据） CSF隐球菌抗原阳性确诊 GM-test, G-test临床诊断,Clinical Infectious Diseases 2008; 46,-D-葡聚糖（G试验）的价值, 酵母菌、丝状真菌细胞壁成分； 用于对系统性真菌病的诊断筛查； 不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属等； 不能检测：隐球菌和接合菌。,-D-葡聚糖（G试验）的价值, 敏感性：63-100%；特异性：74-100% 美国大多数研究限于念珠菌菌血症 其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少 缺点：易引起假阳性（血液透析；接受血制品治疗；药物等），而且无法区分真菌种类。 动态监测可避免假阳性,半乳甘露聚糖（GM）,曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原，用于曲霉感染的早期诊断及治疗的监测；可以从血清、脑脊液、胸水、BALF检测到；敏感性：29-100%；特异性：80-98.7%特点:与症状的消长成正比,可用于疗效观察；阳性结果出现在临床症状和影像学特征之前，对高危人群应进行动态监测（2次/周）。,半乳甘露聚糖（GM）试验的局限性,结果阴性不能排除IA ； 应在经验抗真菌治疗前进行检测； 出现阳性结果，应取另一份标本再次测定; 尚未评价在新生儿或儿童血清中的表现；