miRNA与SiRNA

分子诊断前沿 miRNA检测技术在临床的应用 王岩 Email wangy01 Tel 前言 近些年来 人类发现了许多不同种类的RNA分子 其中最为重要的是小RNA分子的发现 有些小RNA分子能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型 对探索生物进化及防治人类疾病具有重要的意义 RNA的分类 细胞和和胞液线粒体功能 核蛋白体RNArRNAmtrRNA核蛋白体组成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前体小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接 转运小胞浆RNAscRNA 7SL RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分 小RNA分子本身又包含了若干类RNA 根据小RNA的生成 结构和功能大约可分为以下三类 amiRNA microRNA bsiRNA shortinterferingRNA c其他小RNA WhataremicroRNAs 1 1993年 Lee等在秀丽新小杆线虫 Caenorhabditiselegan 中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin 4 miRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的 不编码蛋白质的RNA家族 它们是由19 25个核苷酸组成的单链RNA 3 端可有1 2个碱基长度的变化 miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性 即 在不同组织中表达有不同类型的miRNA 在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达 WhataremicroRNAs 2 miRNA具有高度保守性 即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体 miRNA独有的特征 其5 端第一个碱基对U有强烈的倾向性 而对G却有抗性 但第二到第四个碱基缺乏U 一般来讲 除第四个碱基外 其他位置碱基通常都缺乏CmiRNA执行一定的生物学功能 对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用 一些偏大的miRNA可能参与了基因组的重组装 27nt miRNA的成熟 据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤 1 由长的内源性转录本 pri miRNA 生成70nt左右的miRNA前体 pre miRNA 该过程发生在细胞核 2 将pre miRNA加工为成熟miRNA 该过程发生在细胞质中 Pre miRNA Pre miRNA是由内源性基因间区或内含子的DNA反向重复序列转录而来 它是一种长约70nt的非编码RNA 具有茎 环结构也即发夹状结构 Pre miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNAmiRNA只是pre miRNA茎中的一个臂 miRNA与靶mRNA的作用模式 1 二者不完全互补 即二者不完全时配对结合时 主要影响翻译过程而对mRNA的稳定性无任何影响 如线虫的lin 42 二者完全互补 即二者完全配对结合后 类似siRNA与靶mRNA的结合 特异性的切割mRNA 如miR39 miR1713 上述两种模式均具备 当其与靶mRNA完全互补配对时 直接靶向切割mRNA 而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用 如let 7果蝇 线虫 miRNA与siRNA的区别 miRNA产生 细胞内RNA的固有组分之一 正常 来源 内源转录本直接来源 发夹状pre miRNA结构 单链互补性 不完全互补 存在错配现象对靶RNA特异性 相对较低 一个突变不影响miRNA的的效应途径 miRNA途径对RNA的影响 在RNA代谢的各个层面进行调控功能 调节内源基因的表达在蛋白质合成水平发挥作用 与mRNA的稳定性无关 siRNARNAi的活性形式 病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生 异常 转基因或病毒 外源 长dsRNA双链 3 端有2个非配对碱基 通常为UU完全互补较高 一个突变即引起RNAi沉默效应的改变RNAi途径降解靶mRNA抑制转座子活性和病毒感染在转录后水平发挥作用 影响mRNA的稳定性 miRNA与siRNA的联系 均为Dicer的产物 长度均为22nt左右5 端是磷酸基3 端是羟基均需Argonaute家族蛋白的存在同为RISC的组分二者进化关系上可能的两种推论 siRNA是miRNA的补充miRNA在进化过程中替代了siRNA 沉默机制有重叠 miRNA的分析手段 miRNA的表达检测技术近年来得到了迅速的发展 不仅包括传统的表达文库克隆 Northernblot和荧光定量PCR 还包括新近发展起来的基因芯片技术 克隆和测序法等 而最常用且有效的检测方法便是实时荧光定量PCR法 所谓实时荧光定量PCR技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光光信号积累实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃 而且与常规PCR相比 它具有特异性更强 有效解决PCR污染问题 自动化程度高等特点 相比于其他方法 此法在检测miRNA上更具优越性 所以实时荧光定量PCR法是目前应用最广泛最常用且有效的检测方法 实时荧光定量PCR检测miRNA 这是一项用于检测特异性RNA的技术 RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶加以分离 凝胶分离后的RNA通过southern印迹转移到尼龙膜或销酸纤维素膜上 再与标记的探针进行杂交反应 通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性 它是研究基因表达的有效手段 Northern分析的过程涉及大量人工操作 并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交 因此 它适用于不适用于大规模的筛选实验 Northernblot杂交检测miRNA 基于荧光标记的基因芯片技术检测miRNA 基因芯片 GeneChip DNAChip 又称DNA微阵列 DNAMicorarray 的原理是一种杂交测序方法 即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法 在一块芯片表面固定了序列已知的核苷酸的探针 当带有荧光标记的核酸序列microRNA 与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时 通过确定荧光强度最强的探针位置 获得一组序列完全互补的探针序列 据此可重组出靶核酸的序列 常用检测方式是将反义DNA探针固定在芯片上 通过与5 端标记有荧光分子的miRNA杂交进行检测 此法在高通量检测上具有不可替代的作用 但是在灵敏度特异度等方面还是不及RT PCR miRNA检测的临床应用 一 miRNA检测在肿瘤诊断中的应用癌症是威胁人类和动物健康与生命最严重的疾病之一 miRNA的表达在不同的癌症以及癌症的不同阶段表现出显著差异 在许多癌症的早期阶段和进展中起关键作用 研究表明 miRNA既作为抑癌基因参与控制恶性肿瘤的形成 又作为诱癌基因参与恶性肿瘤的发生和发育 miRNA检测在肿瘤诊断中的应用举例 bcl 2是一个抗调亡基因 在白血病和淋巴瘤等多种肿瘤中过量表达 miR 15a和miR 16 l负调控bcl 2 如果这两种miRNA缺失或下调 则会导致bcl 2表达升高 促进白血病和淋巴瘤的发生 发展 miR 143和miR 145对肿瘤有抑制作用 在结肠癌 直肠癌等细胞系中其表达量相对正常细胞明显下调 相反的 rniR 155在霍奇金淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤中均高表达 而在非霍奇金淋巴瘤中几乎没有发现它的表达 另外 乳腺癌中miR 155和miR 21的表达量显著上调 因此可将miRNA作为生物标记应用于肿瘤的前期诊断 miRNA检测在心血管系统诊断中的应用 略 miRNA检测在神经系统疾病诊断中的应用 略 miRNA是基因表达和蛋白翻译过程中的调节分子 在肿瘤的发生过程中起到调控的枢纽作用 因此把miRNA作为肿瘤生物治疗的靶分子将比编码基因作为靶分子更加有效 miRNA检测的临床应用 2 miRNA的检测可以血清为标本进行 具有无创伤 可重复 可于同一时间点进行检测多项指标等优点 Lawrie等首次对血清miRNA作出研究 发现miR 21在血清中表达 且其表达水平与弥散性B细胞淋巴瘤患者的存活率密切相关 Mitchell等发现miR 141在25例前列腺癌症患者血清中均高表达 且与前列腺特异性抗原 PSA 的表达水平有一定的关系 并经实验证实血清中的miR 141来源于肿瘤 与细胞碎片无关 另外 卵巢癌患者的血液中miR 21 miR 92 miR 93 miR 126和miR 29a与正常人相比明显呈现高表达 除血清外 其它体液也可用于miRNA的研究 发现利用定量逆转录 聚合酶链反应 Qrt PCR 技术可以对尿液 唾液 羊水及胸水中的miRNA进行定量 为研究miRNA开辟了新的途径 以血清为标本进行miRNA检测的意义 小结 从前述的诸多信息 我们可以得出一个结论 那就是RNA不再只是作为DNA与蛋白质之间的中介发挥作用 而是参与到了基因的表达调控 RNA的定点修饰 以及染色体的结构组织等各个方面 短短几年内miRNA研究的迅速突破 不只是RNA研究的一个新突破 更是为人们提供了一种全新的认识基因和基因表达调节本质的角度 同时也使人们开始注意miRNA在疾病发生过程中所扮演角色 不同亚型肺癌患者组织及血浆中miRNA肿瘤标记物的发现及验证 复旦大学附属肿瘤医院 博士生 卢韶华 研究生科研举例 第一部分 不同亚型肺癌患者组织及组织中miRNA肿瘤标记物的发现一 标本及组织学分类 收集复旦大学附属中山医院2007 2009年期间存档的肺癌冰冻新鲜组织标本136例 包括肺不典型腺瘤样增生9例 支气管肺泡细胞癌11例 腺癌26例 鳞癌30例及小细胞癌20例 相应的正常肺组织44例 距离癌组织至少10cm 二 组织制备及激光捕获显微切割 l 手术离体组织切成约1cmx1cmx0 5cm大小的组织块后 立即用OCT包埋 用液氮快速冰冻 并存放入 80 冰箱以待用 2 每块组织连续切片 切片厚度为10 m 并置于膜片上 3 Veritas显微切割仪 LCM 精确分离肺癌细胞 功率30 70mw 脉冲时间2000ms 每个病例获取约l05的细胞 4 切割完毕 立即将LCM盖子盖于盛有400 L裂解液的EP管中 倒置后充分振荡混匀 置于 80 直至RNA抽提 微切割时都有与之相对应的HE连续切片做比对 以准确定位所需细胞 Figure1 Lasercapturemicrodissectionoflungsquamous cellcarcinomaeells 三 RNA抽提和质量监控 用mirVanamiRNAisolationkit抽提总RNA 对RNA的质量监控则通过RNA6000PicoLabchipkit由2100Bioanalyzer来完成 四 全基因组miRNA分析 实验通过LCM从136例不同类型组织 包括肺不典型腺瘤样增生9例 支气管肺泡细胞癌11例 腺癌26例 鳞癌30例 小细胞癌20例 相应的正常肺组织44例 中获取纯净目的细胞 分别用Agilent最新芯片技术进行全基因组miRNA表达分析 该芯片阵列取自Sangerv 10 1数据库 包含723个人类miRNA的探针 每个样本只需l00ng上样量 用Cy3标记后 并经XDRScan PMT100 PMTS 扫描得到信号 标记和杂交的操作方法均参照Agilent芯片说明书 五 数据统计分析 1 miRNA差异性表达分析 1 芯片的图像信息通过scannerControlRev 7 0软件转换为点密度值 这些信号经背景消除后直接导入GenespringGX10软件进行定量Quantile标准化 并由此得到正常组织和病变组织所表达的信号间比值 从生物性重复中获得的平均标准化数据用来做比较研究的分析 一 miRNA差异性表达分析 2 在AgilentmiRNAmicroarray所带的723个miRNA中 有291个基因显示有阳性信号并被用于进一步的数据分析 病变组织上皮细胞与相应的正常组织上皮细胞的miRNA表达相比较时 发现有161个miRNA的表达在不同类型肺癌组织和正常组织中存在着统计学的差异 其中包括31个己报道的miRNA及130个新的尚未见报道的miRNA 运用34个这些差异表达的miRNA可以分别区分正常肺组织和鳞癌 腺癌 小细胞癌 图4A 运用17个差异表达的miRNA可以分别区分鳞癌 腺癌 小细胞癌 图4B Figure4AHierarehicalcombinedtreeNormallungtissueandthreetypesoflungcancers Figure4BHierarchicalcombinedtreeThreetypesoflungecansertissues 实验结果 一 正常肺泡上皮与肺腺癌细胞的miRNA差异性表达分析 在正常肺泡上皮与肺腺癌细胞的miRNA差异性表达分析中发现63个差异性表达miRNA 包括46个新的尚未见报道的miRNA 表IA 以及17个文献报道的miRNA 表1B 其中15 88 个miRNA表达与文献报道一致 二 正常肺泡上皮与肺鳞癌细胞的miRNA差异性表达分析 略 在正常肺泡上皮与肺鳞癌细胞的miRNA差异性表达分析中发现119个差异性表达miRNA 包括95个新的尚未见报道的miRNA 表2A 及24个文献报道的miRNA 表2B 其中19 79 个miRNA表达与文献报道一致 三 正常肺泡上皮与肺小细胞癌的miRNA差异性表达分析 略 在正常肺泡上皮与肺小细胞癌细胞的miRNA差异性表达分析中发现117个差异性表达miRNA 包括95个新的尚未见报道的miRNA 表3A 及22个文献报道的miRNA 表3B 其中20 90 个miRNA表达与文献报道一致 二 预测性分析 运用芯片预测分析方法 PAM及WEAK 对芯片数据进行预测性分析 并把两种数据综合起来得到以下结果 miRNA肿瘤标记物可以区分正常 肺癌组织 miRNA肿瘤标记物则可以区NSCLC SCLC miRNA肿瘤标记物则可以区分AC SQ miRNA肿瘤标记物则可以区分AC SQ SCLC 一 预测正常肺组织 肺癌组织的肿瘤标记物 1 PAM预测分析结果PAM分析结果显示正常组与肺癌组比较 至少有4个miRNA可以组成一组有区分力的数据 PAM分数与上述miRNA区分正常 肺癌的预测力见表4A 十倍交叉验证分析结果表明该组miRNA预测的准确性为96 03 2 WEAK方法预测分析结果 通过对正常肺泡上皮及肺癌上皮的WEAK分析 预测发现13个区分二者的miRNA 表4B 该组miRNA的平均准确性为97 519 3 两种预测性分析结果中重复出现的miRNA 将该水平分类组中的两种不同预测性分析所得的结果相比较 我们发现有7个miRNA至少出现在两种不同的预测方法结果中 这些miRNA的区分能力可能更强大 准确性也可能更高 表4C 二 预测非小细胞肺癌 NSCLC 小细胞肺癌 SCLC 的肿瘤标记物 略 三 预测肺腺癌 AC 鳞癌 SQ 的肿瘤标记物 略 4 实时荧光定量RT PCR验证 参照几TaqmanmicroRNART反应试剂盒说明书 随机选取8个经LCM获取的RNA样本 依次验证16个miRNAs has miR 106a has miR 135b has miR 143 has miR 145 has miR 18a has miR 195 has miR 20a has miR 221 has miR 375 has miR 378 has miR 423 3P has miR 497 has miR 572 hsa miR 638 has miR 7andhaa miR 96 的表达 同时进行的对小RNAU47表达的检测用来作为标准化的质量监控 每个实验至少重复三次 结论 7个miRNA可以区分正常肺组织及肺癌组织 准确率高达98 10个miRNA可以区分非小细胞肺癌及小细胞癌 准确率高达99 9 2个miRNA可以区分例肺腺癌及肺鳞癌 准确率高达93 5 13个miRNA可以区分肺腺癌 鳞癌及小细胞癌 准确率高达95 5 为肺癌分子分型及靶向治疗提供新的理论依据 第二部分 不同亚型肺癌患者组织及血浆中miRNA肿瘤标记物的验证 一 标本及组织学分类收集复旦大学附属中山医院2004 2007年期间存档的结直肠石蜡组织标本144例 肺鳞癌 腺癌及小细胞癌各48例 及48例相应正常对照肺组织 鳞癌及腺癌患者均具有3 5年完整随访资料 小细胞癌生存期短 所有患者均具有2 5年完整随访资料 所有病人对参与科学研究都有知情同意 重新切片和常规HE染色后 由两位经验丰富的病理医生参照2003年世界卫生组织肿瘤分类标准进行诊断和分类 二 方法 1 RNA抽提和质量监控每个组织块连续切片获取20mg石蜡组织 RecoverAllTMTotalNucleicAcidisolationkit抽提总RNA NanoDrop1000Spectrophotometer测定RNA浓度 方法均参照其各自说明书 2 实时荧光定量RTPCR参照TaqmanmicroRNART反应试剂盒说明书 每个样本用100ng上样 验证的对象是通过两种完全不同的芯片预测分析方法所获得的能区分鳞癌 腺癌及小细胞癌的7个miRNA肿瘤标记物 即hsa miR 25 hsa miR 205 hsa miR 34a hsa miR 375 hsa miR 29a hsa miR 29b hsa miR 27a 一 验证正常肺组织腺癌组织的肿瘤标记物 运用MedCalc软件进行受试者工作特征曲线 receiveoperatingcharacteristiccurve ROC 及logisticregression分析 以评估候选miRNA肿瘤标志在分别区分正常肺组织与鳞癌 腺癌及小细胞癌的诊断价值 结果显示 候选的4个miRNA肿瘤标记物能在石蜡组织中鉴别正常肺组织与肺腺癌 p 0 05 表2 其中hsa miR 34a及has miR 27a组合能鉴别肺腺癌准确率达85 AUC 0 898 2 验证正常肺组织与肺鳞癌的肿瘤标记物 结果显示 候选的4个miRNA肿瘤标记物能在石蜡组织中鉴别正常肺组织与肺腺癌 p 0 05 表3 其中has miR 205能鉴别肺鳞癌准确率达90 AUC 0 864 3 验证正常肺组织与小细胞肺癌的肿瘤标记物 略 结果显示 候选的6个miRNA肿瘤标记物能在石蜡组织中鉴别正常肺组织与小细胞肺癌印 0 05 表4 其中has miR 205能鉴别肺鳞癌准确率达90 Aue 0 564 其中has msR 25a及has miR 29a组合能鉴别小细胞肺癌准确率达99 AUC 0 987 验证肺腺癌与肺鳞癌的肿瘤标记物 略 验证肺腺癌与小细胞肺