P-糖蛋白与癫痫耐药

顾浩 P 糖蛋白与癫痫耐药 概念性定义癫痫是一种以具有持久的致痫倾向和相应的神经生物 认知 社会心理等方面后果为特征的脑部疾病 2005年 ILAE和国际癫痫病友会 一 癫痫定义 一 癫痫定义 实用性定义 新 癫痫是一种脑部疾病 符合如下任何一种情况可确定为癫痫 1 至少2次间隔 24h的非诱发性 或反射性 发作 2 一次非诱发性 或反射性 发作 并且在未来10年内 再次发作风险与两次非诱发性发作后的再发风险相当 至少60 3 诊断某种癫痫综合征 符合以下任何一种情况 可以认为癫痫已不存在 1 已经超过了某种年龄依赖癫痫综合征的患病年龄 2 已经10年无发作 并且近5年已停用AEDs 2014年 ILAE 吴立文 等 解读新的癫痫临床实用性定义 中华神经科杂志 2014 二 流行病学资料 1 3 1 全球患病情况WHO调查显示癫痫的患病率约5 7 目前全球癫痫患者超过5000万 2 国内患病情况王文志等调查报道 目前国内约有癫痫患者900万 其中600万左右为活动性癫痫 国内癫痫年发病率约28 8 10万 每年新增癫痫患者约38万 其中宁夏患病率约8 5 居全国之首 3 AEDs治疗现状目前癫痫的治疗仍然以AEDs为主 在发展中国家 人们对癫痫缺乏正确认识以及医疗资源匮乏 大多数癫痫患者得不到合理有效的治疗 存在很大的 治疗缺口 指南 中指出我国活动性癫痫患者的治疗缺口高达63 据此估算大约有400万活动性癫痫患者没有得到合理的治疗 二 流行病学资料 研究表明 新诊断的癫痫患者 如果接受规范 合理的AEDs治疗 70 80 患者的发作是可以控制的 其中60 70 的患者经2 5年的治疗可以停药 但有20 30 的患者对各种AEDs不敏感 产生耐药 尽管各种新型AEDs问世 癫痫耐药依然是癫痫药物治疗中的棘手问题 也是目前研究热点之一 4 癫痫危害癫痫对于个人 家庭和社会带来严重的负面影响 如社会上存在对癫痫病的误解 对癫痫患者的歧视 以及癫痫反复发作 长期服药等均严重影响患者及家庭生活质量 带来沉重的经济负担 同时 癫痫患者的保健 教育 就业 婚姻 生育等 也是备受关注的问题 因此 癫痫不仅是医疗问题 也是重要的公共卫生和社会问题 癫痫耐药目前缺乏统一定义 并且耐药概念尚有争议 2010年ILAE将癫痫耐药定义为 2种正确选择 可耐受的抗癫痫药物经足够疗程及剂量的单药或联合用药仍未能控制发作的癫痫 有学者 BodetR etal 认为 除对第一种抗癫痫药物耐药外 对随后连续多种单一药物或联合用药治疗均无效 并且排除假性耐药后即可诊断癫痫耐药 三 癫痫耐药机制 癫痫耐药机制复杂 仍不十分清楚 主要有以下四种学说 多药转运体学说在BBB上有多种多药转运体 如P 糖蛋白 P gp 多药耐药相关蛋白 MRP 主穹窿蛋白 MVP 乳腺癌耐药蛋白 BCRP 等 其功能是阻止可能有害毒性分子进入脑组织 AEDs要想发挥疗效就必须透过BBB 当这些转运蛋白表达增加或活性增强时 可阻止AEDs穿过BBB到达脑组织 降低AEDs在致痫灶的有效浓度 药物靶点学说是指AEDs作用靶点的分子结构 功能 位置的变化导致AEDs敏感性下降 这种变化可以是遗传基因所决定的 或者是获得性的 即伴随着癫痫发作同时发生 可能是发作 药物治疗的后果 AEDs控制癫痫发作必须作用于脑内的分子靶点 这些靶点包括电压门控式离子通道 神经递质受体以及影响神经递质释放 吸收 转运 代谢的酶 神经网络重组学说认为通过基因 神经递质或微环境的作用引起神经元变性坏死和胶质细胞反应性增生 残留神经元在错误信息的指导下向着非生理方向延伸 与下位突触形成异常连接 形成了病理状态下的兴奋性为主的神经环路 增加了发作的敏感性 并可避开一些重要的药物作用和生理屏蔽 导致癫痫耐药 疾病自身严重性学说耐药是与疾病自身严重性相关的固有特性 由疾病本身的病因学 病理改变所决定 如皮质发育不良本身有轻 中 重之分 直接决定其临床疗效 不同的癫痫综合征其严重性不同 如伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫 BECT 正规抗癫痫治疗预后良好 不典型儿童良性局部性癫痫 ABPE 为BECT变异型 难以控制 预后不佳 常遗留轻至中度智力缺陷 P gp的结构及分布P gp是一个磷酸化和糖基化的能量依赖性跨膜外向转运蛋白 其分子量为170KD 包含1280个氨基酸 由12个疏水跨膜区和两个胞内三磷酸腺苷 ATP 结合点组成 ATP结合点为底物转运提供能量 P gp主要位于毛细血管近血管腔一侧和毛细血管外星形胶质细胞足突上 参与构成BBB 四 P gp与癫痫耐药的相关研究 1 P gp与结构 功能及编码基因 P gp功能其基本功能是作为一个能量依赖性运输泵 将来自大脑的多种有害物质逆浓度梯度转运至细胞外 减少其在大脑中的蓄积 减轻细胞毒作用 P gp底物其底物具有亲脂性并带有阴离子 在膜上有较长的停留时间 可被其转运 如PB CBZ PHT和LTG等陆续被证实为P gp的底物 影响其在体内的吸收和分布 尚无证据表明LEV是P gp的底物 PotschkaH etal P gp抑制剂抗生素类 利福平 免疫抑制剂 环孢素A 钙拮抗剂 维拉帕米 等 P gp的编码基因ABCB1基因位于7q21 1 全长大约100kb 包含29个外显子和28个内含子 超过50个单核苷酸多态性 SNPs 其中位于12号外显子的T1236C 21号外显子的G2677T A 26号外显子的C3435T 是研究其与癫痫耐药相关性常用的位点 P gp二级结构模式图P gp的12个跨膜区在细胞膜上形成一个三维的桶状结构 小圆圈内 箭头 标注了常见的SNPs所在位置 灰色圆圈标注的区域为ATP结合部位 LIYan Hong etal 2 P gp对AEDs的影响 细胞水平用同位素法测定细胞内的AEDs浓度 结果显示耐药细胞内AEDs浓度明显低于正常细胞 TishlerDM etal 用高效液相色谱法测定耐药和正常细胞内AEDs的浓度 发现耐药细胞内AEDs浓度仅相当正常细胞内的1 4左右 对耐药细胞采用维拉帕米干预后 可以提高耐药细胞内AEDs浓度 直观的证实P gp可以限制AEDs进入细胞内 陈英辉 等 动物模型研究发现耐药组中致痫灶P gp的表达明显高于敏感组 加用高选择性的P gp抑制剂后 耐药组大鼠的癫痫发作明显减少 SchmidtD etal 在颞叶癫痫动物模型中 海马区P gp表达增加 该区域AEDs的浓度显著降低 vanVlietEA etal 表明P gp过表达与癫痫耐药有关 癫痫患者用逆转 聚合酶链反应 rt PCR 定量分析了19例难治性癫痫患者手术切除的脑组织标本 其中11例样本的ABCB1mRNA表达水平高于正常值10倍以上 Tishler etal 致痫灶周围组织细胞的P gp表达是邻近组织的1 3 2 0倍 KannanP etal 在癫痫患者的研究中 ABCB1C3435T多态性与耐药可能存在一定的联系 HungCC etal 影响部分AEDs血药浓度 如携带CC基因型者PHT的血药浓度最低 KannanP etal CC基因型患者脑脊液PB浓度低于CT和TT基因型 Basic etal 但也有研究报道ABCB1C3435T多态性 P gp表达与癫痫耐药之间无相关性 TanNC etal AEDs透过BBB P gp表达或 和功能 ABCB1SNPs 影响 影响 3 P gp实验研究 研究方法 研究对象本研究根据病例选择及排除标准 收集癫痫患者187例 按照耐药标准分为耐药组100例 敏感组87例 1 漯河市第二人民医院 2 宁夏农村癫痫示范项目 样本采集上午空腹采集静脉血5ml 置于EDTA抗凝管中 常温下以3000r min离心15min 分离血清及有形成分 行腰椎穿刺术留取患者脑脊液2ml 收集的血清和脑脊液样本保存在 80 冰箱中备用 P gp检测血清及脑脊液中P gp浓度采用ELISA测定 测定步骤严格按照说明进行 ABCB1C3435T分型应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 PCR RFLP 上游引物 5 ACTCTTGTTTTCAGCTGCTTG 3 下游引物 5 AGAGACTTACATTAGGCAGTGACTC 3 反应条件 94 预变性5min 94 变性30s 55 退火20s 72 延伸30s 循环35次 最后72 延伸5min 每10LPCR扩增产物中加入限制性内切酶DPn 0 5L 于37 水浴过夜消化14 16h 3 5 琼脂糖凝胶电泳检测后确定ABCB1C3435T基因型 结果 表1耐药组与敏感组癫痫患者一般临床资料比较 注 由于未分类发作类型的样本量太少 统计时其与部分性发作类型合并 表2耐药组和敏感组患者脑脊液 血清中P gp浓度 以及二者浓度比值比较 野生纯合型 CC 163bp和68bp两条带 突变型 TT 231bp一条带 杂合子型 CT 231bp 163bp和68bp三条带 A DNAMarker B CC型 C D CT型 E TT型 ABCB1C3435T电泳图 目的基因条带 231bp 电泳图A为Marker B B及右侧条带均为PCR产物 表3ABCB1基因C3435T不同基因型患者P gp浓度及比值比较 结论 癫痫患者脑脊液中P gp的高表达与癫痫耐药关系密切 耐药性癫痫患者脑脊液中存在P gp高表达 可能阻碍了AEDs透过BBB 降低脑组织内的药物浓度 导致癫痫耐药的发生 ABCB1基因C3435T位点SNPs可影响癫痫患者脑脊液中P gp水平 即携带CC基因型的癫痫患者P gp高表达 发生癫痫耐药的风险增加 临床意义 P gp在癫痫耐药中可能扮演着重要的作用 为耐药性癫痫药物治疗提供重要的信息 如研发非P gp底物的AEDs 绕过P gp的作用机制 也可研制P gp抑制剂 降低癫痫患者BBB中P gp的表达 提高致痫灶