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实验1 颊粘膜上皮细胞基因组DNA的抽提及ACE基因多态性分析 一 实验目的 掌握从微量来源的组织细胞中抽提基因组DNA掌握PCR技术原理了解基因多态性分析的方法 二 原理 基因组DNA抽提碱裂解法抽提基因组DNA 本实验 用蛋白酶K和苯酚提取大分子DNA裂解 蛋白酶K 沉淀法快速提取DNAACE基因多态性分析PCR方法分析基因多态性 真核生物基因组中非编码序列多于编码序列 基因组 编码序列 非编码序列 调控序列 重复序列 高重复序列 串联排列 大卫星 小卫星 微卫星 中重复序列 散在分布 部分编码 Alu家族 低重复序列或单拷贝 Alu家族重复单位 300bp左右 130 31 130bp具Alu酶切位点30 50万次功能 基因调控Alu元件的插入 删除和重组与许多先天性遗传疾病和癌症相关 ACE基因多态性分析 血管紧张素转换酶 Angiotesinconvertingenzyme ACE 基因诊断 利用现代分子生物学和分子遗传学的方法 从DNA RNA水平检测基因的存在 结构异常和表达状态 从而对疾病做出诊断的方法 基因多态性 指在一随机婚配的群体中 染色体同一基因座位点上有两种或两种以上的基因型 它可决定人体对疾病的易感性 临床表现多样性和对药物治疗反应的差异性 理论基础ACE基因第16内含子存在一段长度为287bp Alu序列 的插入 缺失 I D 多态性片段 I D多态性与血液ACE水平有明确关系 DD型ACE水平最高 ID次之 II最低 左室肥大患者中DD型频率明显增高 实验原理以DNA为模板 ACE基因特异的引物序列位于287bp插入 缺失片段的两侧进行PCR扩增 故II型扩增片段长度约为490bp DD型扩增片段长度约为190bp ID型扩增片段为 个 分别为190bp和490bp 根据PCR扩增片段的大小可进行多态性分析 插入片段 插入型 缺失型 操作步骤 基因组DNA抽提PCR反应琼脂糖凝胶电泳检测 1 基因组DNA抽提 溶液 10ml漱口20秒收集漱口水 3000g 5min RT 弃上清 溶液 250ul重悬沉淀 3000g 1min 弃上清 溶液 250ul重悬沉淀 振荡10秒 变性 转至0 5ml离心管 99 5min 加溶液IV50ul振荡5秒 中和 3000g 1min 上清转移至新0 5ml离心管 取5ul用于PCR 2 PCR反应 取消毒的0 5ml离心管 加入下列成分 10 PCRBufferdNTP 2 5mMeach mix 10 lTaqDNApolymeraseDNA模板5 l引物混合物 10 Meach 2 lddH2O3 l总体系20 l扩增程序为 94 变性30s 55 复性30s 72 延伸40s 共反应35个循环 琼脂糖电泳检测 制备
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