基因克隆技术在葡萄研究中的应用.doc

基因克隆技术在葡萄研究中的应用（西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100）摘 要：本文从克隆工具及相关方案研究、基因克隆用于序列分析、葡萄生产相关基因的克隆与表达、用葡萄基因构建其它转基因生物、转基因技术面临的挑战与解决方案综述了基因克隆技术在葡萄研究中的应用，并并对相关问题进行了讨论和展望。关键词：基因克隆；葡萄；应用The application of gene cloning in study of grapeSONG Chang-zheng(College of Enology, Northwest AF University, Yangling, Shaanxi 712100, China)Abstract：we summarized the application of gene cloning in study of grape from the following points: tools of gene cloning and the optimizing of the study, the use of gene cloning in sequence analysis, cloning and expressing of the relevance genes in grape production, structure of other organisms with genes from grape, challenge of transgenosis and solution. Furthermore we discussed related issues and had a look into the distance.Key words: gene cloning; grape; application引言葡萄是世界主栽果树之一，产量仅次于柑桔位居第二。世界年生产葡萄的80用来酿酒，16鲜食，4制干(王华和张继澍. 2003)。多年来各葡萄生产国政府和科研工作者均十分重视葡萄的生产和科研工作。基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20世纪70年代初DNA体外囊组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践(陈儒钢, 巩振辉等. 2009)。目前基因克隆技术包括功能克隆，定位克隆，转座子标签法，抑制性差减杂交，同源序列法，基因芯片，电子克隆等(陈儒钢, 巩振辉等. 2009)，每种克隆技术都有特有的功能用途。随着生物技术的飞速发展，人们越来越多地把目光投向具有商业价值的转基因植物。葡萄遗传中已有许多可以利用的目的基因，越来越多的目的基因已被克隆测序分析，或者导入葡萄中。同时，葡萄基因组中的一些基因也被作为目的基因转入其它生物（如酿酒酵母及其他作物）中。1. 克隆工具及相关方案研究在常规的基因克隆过程中常见工具包括引入外源DNA的工具，稳定转基因DNA的工具，选择标记，以及合适的启动子、终止子等(Schuller and Casal.2005)。引入DNA的工具即载体，目前已经有一系列构建的穿梭载体用于促进目的基因在工程酵母中的表达。被引入的载体必须具有在转化菌株中自我复制的能力并能传递给后代。目的基因在重组菌株中可以通过载体的自我复制或者与宿主基因组整合而得到稳定(Schuller and Casal 2005; Fang, Salmon et al. 2011)。通常是通过标记基因编码可以催化解毒的活性酶，或者是让菌株发生对抗生素不敏感的突变,从而达到筛选重组菌株的功能。在将葡萄中的目的基因克隆转化到酿酒酵母的研究也有很多，在构建工程酵母过程中的标记基因，包括隐性，半显性，显性标记(Cebollero, Gonzalez-Ramos et al. 2007)。隐性基因如URA3或者LEU2最为普遍。然而，因为酿酒酵母菌株通常都是原养型的，这些标记基因都不能被使用。相比之下，显性或者半显性选择标记的优点在于可以应用于任何菌株。例如，环己酰亚胺抗性基因，一个编码突变体核糖体蛋白L29的半显性标记(Prez-Gonzlez, Gonzlez et al. 1993)；使用更多的还有用于工业酿酒酵母转基因的G418抗性基因(Wach, Brachat et al. 1994)。在植物转基因过程中，通常两种标记基因也要引入：允许进行细胞筛选的选择基因和可供观察转基因发生的报告基因。较多使用的选择基因有新霉素磷酸转移酶基因(nptII)，对应抵抗卡那霉素；潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，抵抗潮霉素以及氨基转移酶，赋予除草剂抗性。uidA编码的葡萄糖醛磷酸酶被广泛用作报告标记，但是有破坏分析成分的缺点。因此，水母绿色 荧光蛋白成为了最受欢迎的可视化标记(Vidal, Gomez et al. 2010)。在大多数情况下，为了让目的基因尤其是异源基因在宿主体内较好地表达，强启动子和强终止子会被使用到(Schuller and Casal 2005)。在转基因葡萄构建过程中常用的介导转化的菌株是农杆菌，而在构建工程酿酒酵母中常常使用穿梭质粒在大肠杆菌中扩增，或者直接转入酿酒酵母(Cebollero, Gonzalez-Ramos et al. 2007; Vidal, Gomez et al. 2010)。转基因植株再生的过程：(i)初始培养，如胚胎发生组织；(ii)将目的基因转入细胞或者细胞簇；(iii)选择性诱导类胚胎细胞结构；(iv)结构萌发成非嵌合的苗木(Vidal, Gomez et al. 2010)。相关转基因方案的研究也比较多。杨丽娜等以美人指葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnas 基因的受体, 对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头抱霉素浓度等因素进行了研究。 结果表明，最佳的农杆菌介导美人指葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min, 共培养3 d,预培养3d,卡那霉素选择压3.0 mg/L, 头抱霉素质量浓度250 mg/L。采用此体系对美人指葡萄进行转化,共获得12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%(杨丽娜, 刘捷等. 2009)。王彦立等以优良无核葡萄品种莫利莎葡萄试管苗为试材,研究了卡那霉素(Kan)、潮霉素(Hyg)对葡萄继代苗生长和离体叶片再生的影响.以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)对葡萄离体叶片再生的影响,以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度(王彦立, 贺柱等. 2009)。李金凤等探讨了不同预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素抑菌浓度等因素对葡萄砧木5BB遗传转化的影响，以优化农杆菌介导法转化的遗传转化体系，为葡萄砧木的转基因育种提供条件。试验中发现，随着侵染时间和共培养时间的延长，葡萄砧木5BB不定芽再生率逐渐下降；但时间过短，叶片的GUS瞬时表达率只有20以下；葡萄组织对卡那霉素非常敏感，砧木5BB在3mg/L时已没有再生苗，与庄智敏等的研究结果一致(李金凤, 杨丽娜等. 2009)。Antonio-Jose等研究了鲜食葡萄品种绿宝石和克瑞森无核在低根癌农根菌浓度下高效率遗传转化方案的开发。得到了高效率转化方案，并从低浓度根癌农根菌中的胚胎发生的愈伤组织得到绿宝石和克瑞森无核转基因植物(Velasco, Pazos-Navarro et al. 2008)。2. 基因克隆用于序列分析宗成文等为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp。同时发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性(宗成文, 章镇等. 2010)。MADS-box转录因子在多种植物的发育过程特别是花器官和果实发育过程中发挥重要的作用。宗成文等为了从葡萄中克隆出新的MADS-box基因,研究在葡萄花及果实发育中的作用,根据多种植物MADS-box基因保守区序列,应用RT-PCR技术从红富士葡萄花序中分离出34条MADS-box基因cDNA片段。这些片段长度在138152 bp之间,推导的氨基酸序列与已登录的欧洲葡萄及其它物种的MADS-box基因同源性超过83%。用推导的氨基酸序列与已知的欧洲葡萄和拟南芥MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明葡萄中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因(宗成文, 房经贵等. 2007)。李慧娥等于葡萄黑痘病发病盛期,用病叶压片法对高抗黑痘病的中国野生毛葡萄商-24接种黑痘病病原菌,采用mRNA差异显示技术进行抗黑痘病基因表达差异的研究.结果获得了T11GG/B0304-400等9个基因表达差异cDNA片段；采用RACE技术克隆了T11GG/S438-353 mRNA片段的cDNA全长序列;序列分析表明,其编码氨基酸序列与拟南芥、欧洲葡萄、柳杉、党参、无梗花栎、欧洲栗及寄生草钙调蛋白的一致性分别为99%、97%、94%、91%、90%、88%和77%。表明该实验克隆到了负向调控中国野生毛葡萄抗黑痘病的钙调蛋白基因,并命名为VqCaM,其GenBank登录号为EU694099;实时荧光定量PCR结果再次验证VqCaM表达受葡萄黑痘病侵染下调(李慧娥,王西平等.2010)。李小明等从葡萄中克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并对其序列进行生物信息学分析。测序结果显示其cDNA序列全长为1 257bp,含有一个1 179bp的开放阅读框.生物信息学分析表明葡萄白藜芦醇合酶基因编码392个氨基酸,分子量为42.9kDa,理论等电点为5.97,具有芪合酶家族固保守结构域,二级结构主要由-螺旋、无规则卷曲、延伸链和-转角组成(李小明,郭丽琼,等.2011)。C. Verris等通过克隆及序列分析报到了嵌合基因AdhrVine-1，即将逆转录因子Vine-1插入Adhr的基因。他们通过Adh基因组文库筛选出两个比一般Adh基因长的拷贝(3111 and 11111)，它们实际上是普通Adh基因插入了2.39 kb的片段，命名为Adhr，插入的片段命名为Vine-1。他们克隆并测序了Adhr基因的被内切酶NcoI分开的三个片段，并对Adhr的结构，Vine-1的结构，Vine-1在不同葡萄属植物Adhr基因中插入，Vine-1相关序列在葡萄属基因组中的分布进行了分析。得出以下结论：Vine-1是插入Adh gene家族的新成员Adhr中的序列，该发现表明这个多基因家族可能还具有其他功能。Vine-1探针表明该元素可能有助于酿酒葡萄的遗传变异，但不是无性系之间的变异性。对基因组中含有该元素的区域的分子研究将有助于深度阐明它在葡萄属基因组演变与功能上的作用。Vine-1相关元素也可能成为深度研究不同葡萄属以及不同葡萄栽培品种之间进化关系的分子工具(Verries, Bes et al. 2000)。传统认为，鲜食葡萄红衣主教是由火焰蛤蜊葡萄和瑞必尔杂交获得。但是，A. Akkak等通过DNA定型发现不是通过这种杂交得到的。具体过程是结合nSSR标记技术，通过克隆VVS5微卫星位点等位基因片段将其连接在T载体上进行测序及序列分析。分子遗传学证据表明红衣主教与火焰蛤蜊没有亲缘关系。并首次提出，火焰蛤蜊是ahmer bou amer在VVS5微卫星位点突变的株系(Akkak, Boccacci et al. 2007)。3. 葡萄生产相关基因的克隆与表达几丁质酶是病程相关蛋白的一种，在抑制真菌的生长和发育，以及植物对真菌、病虫害、线虫的防御中发挥着重要作用。仲健等采用RT-PCR方法,以葡萄幼叶为材料克隆几丁质酶基因的cDNA序列, 对所克隆的基因在体外进行了真核表达和纯化，同时也对其分解几丁质的能力进行了测定，以便为其今后的定点突变和结构功能域的研究奠定基础（仲健,朱沙等.2009）。徐章逸等利用RT-PCR技术扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)中国分离物的外壳蛋白(cp)基因。序列分析结果表明,cp基因的长度为942 bp,与已报道的其它GLRaV-3分离物的cp核苷酸相似性为91%99%,编码的氨基酸相似性为95%100%.将此基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后用终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,cp在大肠杆菌中可表达出分子量约为35 kDa的蛋白.纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)及斑点免疫结合测定(DBIA)结果显示,制备的特异抗血清可用于检测田间感病葡萄样品中的GLRaV-3（徐章逸,王国平.2010）。赵冬兰等将葡萄卷叶伴随病毒的CP基因克隆到表达载体pET-30a中，转化大肠杆菌BL21，筛选得到阳性克隆GB-1，用IPTG诱导使其表达。SDS-PAGE电泳分析表明，该CP基因在大肠杆菌BL21中得到大量表达。用该病毒的CP抗血清通过间接ELISA证明所表达的蛋白具有很好的抗原性。为制备高效价的CP抗体提供了良好的试验材料，同时也为抗GLRaV-3转基因葡萄的培育和其分子生物学的深入研究奠定了基础（赵冬兰,朱水芳等.2001）。李红叶等用RT-PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物(GFLV-H)基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段,并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector，进行了相关序列分析，目前基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121,经三亲交配导入到根癌农杆LBA4404中（李红叶,陈力耕等.2003）。徐伟荣等将质粒pSB166中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303,构建了中间表达载体pWR306;以中国野生葡萄华东葡萄白河35-1 cDNA为模板,通过PCR扩增出葡萄芪合成酶基因(STS)、醛脱氢酶基因(ALDH),与pGEM-T Easy克隆载体连接,获得重组质粒pGEM-TEasy-STS和pGEM-TEasy-ALDH;双酶切重组质粒及表达载体pWR306,将STS、ALDH基因片段与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了葡萄芪合成酶基因及醛脱氢酶基因的植物表达载体pWR-STS、pWR-ALDH,并用改进冻融法导入农杆菌GV3101（徐伟荣,王跃进等.2005）。郝炜等根据中国野生葡萄芪合成酶基因cDNA序列,设计1对PCR引物,以野生种华东葡萄白河-35-1 5RACEcDNA第一链为模板,克隆该目的基因。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化Escherichia coliBL21,经诱导后表达出约66 kD的融合蛋白.该融合蛋白主要以包涵体形式表达,经变性剂溶解、梯度透析,对该包涵体进行复性,复性蛋白通过与Glutathione Sepharose 4B Fast Flow结合、洗脱,获得了纯化的芪合成酶融合蛋白.以洗涤纯化的包涵体作抗原免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1:3000)与芪合成酶融合蛋白识别反应良好。该研究为该基因功能的体外验证及转芪合成酶基因植物的检测提供了依据（郝炜,王跃进等.2006）。依据同样的原理，余义和等为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,也以白河35-1为材料,得到VpRFP1基因的开放阅读框；将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichicacoli)BL21;经WTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Westem blot检测免疫，抗原反应良好。该研究结果表明,在27、0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析（余义和,徐伟荣等.2011）。CECILIA B. AGERO研究了在葡萄中表达梨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白pPGIP基因能否增强葡萄灰霉菌和苛养木杆菌（或称木质部难养菌）所引起的病害的耐受性。汤姆森无核和霞多丽被转入pPGIP基因，并检测了pPGIP活性和蛋白表达以及对灰霉菌和苛养木杆菌的感染的耐受性。实验表明，pPGIP及伴随产物提高了这两个葡萄品种对该病原菌的耐受性。并首次证明PGIP到达木质部并通过接合部。同时也发现PGIP活性的增加也导致一种木质部杆菌引起的病害PD发生的延迟(Aguero, Uratsu et al. 2005)。4. 用葡萄基因构建其它转基因生物张雅丽等将葡萄蔗糖转运蛋白VvSUC27cDNA以反义方向插入到含有CaMV35s启动子的真核表达载体pBI121载体中,然后转化到烟草植株中.转反义VvSUC27cDNA的烟草植株在含有20 g/L蔗糖的培养基上能够正常生长发育,但是通过切片观察,发现其根部发育较弱,且叶片叶绿体含量增加，可溶性糖测定发现,转基因烟草根部蔗糖含量只有野生型烟草的51%。14C蔗糖吸收实验发现转基因烟草转运外界蔗糖的能力大大降低（张雅丽,孟庆勇等.2006）。葡萄醪含有各种对葡萄酒香气有重要影响的萜烯醇，这种代谢产物的量依葡萄品种而不同，许多栽培品种是无芳香特性的(Rusjan 2010)。酵母菌，比如酿酒酵母，不能生成、分泌萜烯类化合物主要是因为缺少萜烯合成酶。通过代谢工程，Oscar Herrero等对酿酒酵母的一个酿酒菌株改良了类异戊二烯化合物的生物合成途径，表达来自仙女扇的芳樟醇合成酶基因。在小容器酿造条件下，重组体酵母有效地分泌出了高于人类感觉阈值水平的芳樟醇，并且其他优良的发酵特性没有受到影响。该研究成果对未来通过基因操控影响葡萄酒品种香气或者在其他酒精类饮品的应用很有前景(Herrero, Ramon et al. 2008)。白藜芦醇是在少数植物（如葡萄，花生等）中合成的，在葡萄皮中含量较多，而在果肉中含量很少，因此红葡萄酒中含有白藜芦醇，而白葡萄酒中几乎没有。白藜芦醇还具有许多医疗保健作用，如抗氧化、抗肿瘤、抗血小板凝聚、抗细菌和真菌、防止人体低密度脂蛋白氧化等，因此，它已成为科学家们高度重视的天然活性成分(Gonzlez-Candelas, Gil et al. 2000; Becker, Armstrong et al. 2003; Zhang, Li et al. 2006; Halls and Yu 2008; Wang, Halls et al. 2011; Wang and Yu 2011)。白藜芦醇合成途径中，4-肉桂酸羟化酶（C4H）催化4-肉桂酸生成4-香豆酸，再由香豆酰辅酶A连接酶（4CL)）和白藜芦醇合酶（STS）作用下生成白藜芦醇。基于这种认识，许多研究者通过不同方法构建白藜芦醇合成途径。有研究表明，红细菌属的TAL基因可以直接催化L-酪氨酸生成4-香豆酸，但是细菌与酵母菌遗传密码子的差异会限制该蛋白在酵母中的表达(Zhang, Li et al. 2006)。另有实验表明树胶醛糖运输蛋白（araE）对白藜芦醇高水平积累起到重要作用(Wang and Yu 2011)。最近的研究，通过构建含有araE基因，“突变”TAL基因，4CL基因和STS基因的表达载体，让工程酵母在酿酒条件下合成了高含量的白藜芦醇，并且所生产的白葡萄酒中白藜芦醇含量高于大多数市面上的红葡萄酒(Wang, Halls et al. 2011)。Ilaria Ingrosso等开发了一个新的诱导番茄单性结实的方法，即将葡萄的白藜芦醇合酶基因转入番茄开花组织中。结果获得了两组不同白藜芦醇合成水平的转基因番茄35SS和LoxS 。实验表明两组番茄的花朵中都有白藜芦醇的合成，进一步研究表明白藜芦醇的合成导致了花粉结构的破坏，显微观察表明孢粉素的生物合成前体阿魏酸被显著消耗，揭示了花粉败育是因为结构化合物的合成受损。该实验对白藜芦醇的合成在番茄单性结实中所起作用的首次揭露(Ingrosso, Bonsegna et al. 2011)。5. 转基因技术面临的挑战与解决方案综合前文，可以发现转基因技术在现今科研工作中的发挥重要作用。但是它同时也面临着各种挑战与压力。用转基因葡萄和转基因酵母生产出的葡萄或者葡萄酒因为这一特殊技术而被加上了转基因食品的标签。欧盟民意调查,2001年对16000名欧洲人的调查显示出科学技术广义化的积极论调，但是科技进步并不是对所有问题都是万能的。几乎所有（95%）回答者表示因为消极的态度而没有选择过消费转基因食品，60%的人表示转基因生物对环境有潜在的负面影响(Dunn, Levine et al. 2005)。转基因生物(GMO)在食品中的应用在欧洲，美国以及大多数其他国家都被严格管制 (Cebollero, Gonzalez-Ramos et al. 2007)。批评者对转基因技术的担忧包括食品营养质量的改变，潜在的毒性，可能的抗生素抗性，转基因食品潜在的应变原性（致敏性）及致癌性，环境污染，无意识的基因转移，创造新病毒和毒素的可能性，宗教，文化和道德上的担忧，以及对未知的恐惧(Cebollero, Gonzalez-Ramos et al. 2007)。法规条例明确界定转基因生物及其标记的产品的构建和安全评价，这是辅助消费者做出知情选择的关键步骤，并且在不远的将来会显示出这种策略能否减小消费者消极的消费观(Schuller and Casal 2005)。同时，我们也要不惜一切代价地去杜绝以下行为：进行明显危险实验；掩盖科学数据，谎称食品和环境安全；科学数据倾斜，利用消费者困惑让政治和经济保护主义正当化；受利益驱使，在不清楚利弊的情况下 让消费者“强制进食”转基因产品(Pretorius and Bauer 2002)。6. 讨论与展望生物的基因是一片海洋，在基因克隆的领域，人类已经迈出了坚实的步伐。但葡萄基因克隆的研究仍任重而道远，基因克隆的进展依赖于基因克隆技术的发展与创新。在科学技术与生活水平快速发展的今天，相信生物技术具有潜在的效益是毋容置疑的。只是，现在有太多的错综复杂的原因，科学的，技术的，经济的，市场的，安全的，法律的，社会的，和道德的屏障需要去克服。作为一项新兴的科学技术，我们肯定是期望它能给我们带来巨大的利用价值，服务我们的生活，造福社会。但是，在真正可以推广转基因产品之前，我们必须保持客观的态度。因为短期的利益而不切实际地期望转基因葡萄或者酵母的商业化是荒谬的，而不顾转基因葡萄和酵母对葡萄及葡萄酒产业的巨大潜在效益也同样是不明智的。广大相关科研工作者更希望自己的成果可以造福人类。伟大的科学进步在得到广泛认可之前，往往会遭遇各种阻力。我们相信，对转基因技术真正理性客观正确的评判将会到来，并且人们不再有对未知的恐惧，放心地享受转基因带来的福利。ReferencesAguero, C. 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