细胞蛋白提取方法_第1页
细胞蛋白提取方法_第2页
细胞蛋白提取方法_第3页
细胞蛋白提取方法_第4页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

单层贴壁细胞总蛋白的提取1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2. 每瓶细胞加3ml 4预冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3. 【配制裂解试剂，现用现配制】按1ml RIPA + 25l PMSF（100mM） + 110l Pi（PhosSTOP磷酸酶抑制剂），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4. 每瓶细胞加100 l的裂解液，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5. 裂解完后，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）6. 于4下12000rpm离心15 min。（提前开离心机预冷）7. 将离心后的上清分装转移倒0.6ml的离心管中放于-80保存。RIPAPMSFPi(磷酸酶抑制剂)2瓶细胞（25cm2）200l5l22l4瓶细胞（25cm2）400l10l44l10瓶细胞（25cm2）1ml25l110lPhosSTOP磷酸酶抑制剂（stock solution）配制方法：1片PhosSTOP+1ml RIPA，充分溶解后按110ul封装9管。-20保存有效期6月，4保存有效期1月。BCA法测定蛋白浓度检测试剂准备：1 BCA工作液（室温）2 RIPA（1ml）（4）3 蛋白工作液（0.5mg/ml）（4）4 96-Well板5 冰盒6 待测样品（4）操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。A:B（50:1）（含8个标准孔）BCA试剂ABCA试剂B5个待测样品3ml60l10个待测样品4ml80l15个待测样品5ml100l20个待测样品6ml120l2. 标准孔加样96-Well12345678RIPA（l）2019181612840标准品（0.5mg/ml）012481216203. 待测样品稀释20倍，19l RIPA + 1l（待测样品）4. 测
人人文库> 全部分类> 应用文书 > 事务文书

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论