肽结合力与稳定性实验相关知识

本科生毕业设计相关内容课题背景知识：CD8+T细胞免疫应答中起重要作用。CD8+CTL(CytotoxieTlymphoeyteepitopes)对靶细胞发挥杀伤作用，必须能识别靶细胞表面与相应MHC-I类分子结合的特异性抗原表位，即CTL表位。课题组已经根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，对蛋白抗原的HLA-A2/ HLA-A3限制性CTL表位进行了预测分析，初步筛选到表位。通过T2细胞结合力以及稳定性试验，对初步筛选的表位进行验证，获取与HLA分子具有高结合力的表位，用于后续体外免疫活性检测。一、 T2细胞结合力实验相关文献（一）理论知识 1 什么是T2细胞? T2细胞是内源性抗原提呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷的细胞株1 ，为HLA-A2 阳性的T, B 淋巴细胞杂交瘤细胞，可用于研究抗原递呈过程和T细胞与MHC- 分子的相互识别2 。2 为什么要做结合力试验? MHC-I类分子与CTL表位的有效结合是特异性细胞免疫应答的一个重要环节。因为个体内仅存在少数几个型别的MHC-I类分子，由于每个MHC-I类分子可与一系列同种类的抗原肽结合.进而形成多种多样的MHC-肽复合物，这样就使机体免疫系统可以针对众多抗原发生特异性的免疫应答。另外，在细胞外游离肽浓度近乎为零的环境中，MHC-I类分子还必须使相应的抗原肽在细胞表面保留足够长的时间，实现特异性CD8+ T细胞对它的识别。有文献报道1 绝大多数CTL表位以高或中等亲和力与MHC-I类分子有效结合。3 什么是T2细胞结合力实验? 由于T2其自身不能提呈抗原肽到HLA-I类分子上，所以T2细胞表面空载的HLA-A2分子表达极不稳定，表达后很快降解。但当有外源性抗原肽与之结合后，HLA-A2的表达就被稳定。抗原肽与HLA-A2的结合力越强，则T2细胞表面HLA-A2分子的降解就越少，表现为表达量越高。T2表面HLA-A2分子表达量的增加直观地反映了外来抗原肽与HLA-A2的结合力1 。 4 怎么设计候选表位肽T2细胞的结合力实验?（1）阳性对照，文献中报道的大家公认的与T2细胞有强的结合力的多肽；（2）阴性对照，单纯的PBS；（3）背景对照，不用多肽冲击的T2细胞；（4）肽与T2细胞的结合力的判定依据：A、浓度对比法来表示待测肽与HLA的相对亲和力(RA)。RA=诱导HLA表达20%的待测肽的浓度/诱导HLA表达20%的阳性肽的浓度，RA值越小，肽与HLA的亲和力越强3-4 。B、间接免疫荧光法检测各肽与HLA-A2.1分子的结合情况。外源性多肽与T2细胞表面MHC I类分子的结合可使其表面MHC I类分子的表达量增加，两者结合越稳固，可检测到的MHC I类分子越多，最终以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数（FI）作为衡量指标1-2, 5 。尽管不同的文献报道的FI的算法略有差别。（二）具体实验方法 1 Measurement of peptide relative affinity (RA) for HLAA*0201. （1）Briefly, T2 cells were incubated with various concentrations of peptides (0.1100M) for 16 hours and then stained with the mAb BB7.2 to quantify the surface expression of HLA-A*0201. For each peptide concentration, the HLA-A*0201-specific staining was calculated as the percentage of the staining obtained with 100 M of the reference peptide HIVpol589 (IVGAETFYV). The RA is determined as the ratio between the concentration of each peptide and the concentration of the reference peptide that induces 20% of HLA-A*0201 expression4 。 （2）T2 cells (3 x105 cells/ml) were incubated with various concentrations of peptides ranging from 100 to 0.1 M in serum-free RPMI 1640 medium supplemented with 100 ng/ml human 2m at 37C for 16 h. Cells were then washed twice and stained with the BB7.2 mAb, followed by FITC-conjugated goat anti-mouse Ig mAb to quantify the expression of HLA-A*0201. For each peptide concentration, the HLA-A*0201-specific staining was calculated as the percentage of the staining obtained with 100 M of the reference peptide HIVpol589 (IVGAETFYV). The relative affinity (RA) is determined as: RA =concentration of each peptide that induces 20% of HLA-A*0201-expression/concentration of the reference peptide that induces 20% of HLA-A*0201 expression. The definitive RA value for each peptide was determined from at least three independent experiments3 。 2 间接免疫荧光法检测各肽与HLA-A2.1分子的结合情况 （1）首先将1x106/ml的T2细胞用冰PBS、800r/min 离心6 min，洗涤3 次后，再与10g/ml 的候选肽37oC共孵育4h。孵育好的细胞用冰PBS，同样离心条件洗涤3次，加入100l BB7.2 杂交瘤细胞培养上清液，冰浴40min。PBS洗涤3 次，加入100l 1:100 稀释的二抗FITC标记的羊抗鼠IgG溶液，在冰上孵育40min，洗涤后于流式细胞仪检测平均荧光强度，波长488nm。阳性已知肽MAGE-2112-120作为阳性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞为背景对照。荧光系数（FI）=(样本平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度5 。 （2）首先将1x106 个T2 细胞用冰PBS, 800r/min离心6 min, 洗涤3 次后, 再与10 mg/ml 待测肽37oC 共孵育4 h. 孵育好的细胞用冰PBS, 同样离心条件洗涤3 次, 加入100 mL BB7.2 杂交瘤细胞培养上清液, 冰浴40 min. PBS 洗涤3 次后, 加入100 mL 稀释度为1:100 的FITC-羊抗鼠IgG溶液, 在冰上孵育40 min, 洗涤后于流式细胞仪(FACS)检测平均荧光强度, 波长488 nm. 以单纯的T2 细胞加二抗为阴性对照, T2 细胞加一二抗为背景对照。荧光系数(FI) =（样品平均荧光强度-背景平均荧光强度）/（T2细胞荧光强度-背景荧光强度) 1002 。 （3）首先收集T2细胞，用冰PBS洗三次后，调细胞浓度至1 x 106/ml，铺于96孔板中，10l/孔。再与50M的候选多肽，2.5 g/ml的(2微球蛋白于370C 、5% CO2孵箱中共孵育18h。之后，收集孵育好的细胞，用冰PBS洗三遍，加入2l FITC标记的HLA-A2特异性的mAb BB7.2，放置4冰箱，孵育30min，之后PBS洗三遍，接着用流式细胞仪检测平均荧光强度。用已经证明的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位肽SSp-1作为阳性对照，多肽OVA257-264作为阴性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞作为背景对照。结果判定:以荧光系数(FI)作为衡量指标。荧光系数(FI)=（样本平均荧光强度一背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度。多肽的FI 1被认为是高亲和力的表位1 。 （4）T2 cells were incubated for 3 h in humidified 5% CO2 chamber at 37C with each peptide. Anti-HLA-A2.1 monoclonal antibody, BB7.2, was added in saturating amount and incubated for 30 min at 4C. After two wash steps with cold PBS, fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled F(ab)2 fragments of goat anti-mouse IgGwere added and incubated for another 30 min at 4C. The cells were washed twice with cold PBS and fluorescence was measured on a FACScan flow cytometer。The fluorescence index was calculated by the formula: FI=(mean fluorescence of sample-mean fluorescence of background)/(mean fluorescence of T2-mean fluorescence of background)x1006 。 （5）T2 cells were incubated with 50 M of the synthesized peptides and 3 g/ml of human 2-microglobulin in serum-free RPMI 1640 medium for 16 h at 37C/5% CO2. Expression of HLA-A*0201 on T2 cells was then determined with FACS Calibur Xow cytometer by staining with antiHLA-A2 Ab derived from BB7.2 and FITC-labeled goat-antimouse IgG used as the second antibody. The data were analyzed using CellQuest software. The Xuorescence index (FI) was calculated as follows: FI = (mean FITC Xuorescence with the given peptide-mean FITC Xuorescence without peptide)/(mean FITC Xuorescence without peptide). Samples were measured in three replications.7 （6）我们实验室所做的T2细胞结合力试验：待测肽 (50 g/ml) 加入含2微球蛋白 (3 g/ml) 的无血清RPMI1640培养基中37 共孵育18h-24 h后，冷PBA洗涤3次，加100 l稀释度为1:200的一抗（T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人2-M），4 放置30 min。冷PBA洗涤3次后，加50 l稀释度为1：50的FITC-羊抗鼠IgG溶液，4 放置30 min，洗涤后于流式细胞仪检测。另外,已被鉴定的 Flu matrix58-66 (GILGFVFTL)和Flu NP265-273 (ILRGSVAHK)在该实验中分别作为 T2A2 和 T2A3 的阳性肽，PBS作为阴性对照。结果用荧光系数(FI) 表示：荧光系数(FI) = (表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。如果FI1.5，说明候选肽与HLA-A*0201/03具有强结合力；1.5FI1.0：中等结合力；FI0.5：弱结合力（阴性结果）8 。总结（上述红色部分为各文献中的差异部分）： 1 在备选的两种T2细胞结合力实验方法中，优先选择第二种，即间接免疫荧光法。因为我们实验室以前采取的也是这种方法，已经有一定的实验基础，并且实验结果也比较明显。我认为关于低亲和力候选表位的改造可以考虑第二种方法，因为其直观性比较强。 2 关于用间接免疫荧光法检测候选肽与HLA结合力的实验设计方面：A、不同的文献报道了不同的荧光系数算法，甚至是同一个实验室同一作者的不同报道均