microRNA在各种疾病中发挥的作用.doc

microRNA在各种疾病中发挥的作用微生物与生化药学 金靖 S0930580摘要 MicroRNA（miRNA）是一类可负性调控基因表达的长度约为 22 个碱基左右非蛋白编码的RNA 家族，主要功能是调节生物体内与机体生长、发育、疾病发生发展过程有关的基因的表达调控。miRNA 在肿瘤、心血管疾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和艾滋病等多种疾病中都起着重要作用。本文将对miRNA与人类疾病的关系作一综述。关键词 microRNA 疾病The role of the microRNA in a variety of diseasesAbstract MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs involved in negativeregulation of gene expression. Their major function is the regulation to the gene expression of growth、development and diseases. miRNA plays an important role in cancer、cardiovascular diseases、diabetes、Alzheimers disease、Parkinsons disease、 AIDS and so on. This review summarizes the relation between microRNA and diseases.Key words microRNA diseasesMicroRNA (miRNA)是一类可负性调控基因表达的长约 22nt的非编码的单链 RNA分子，广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中，其通过碱基配对的方式结合到靶mRNA，从而抑制其翻译，但不影响其转录。最早发现 miRNA是在 1993 年，Lee 等研究人员在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中发现了控制着线虫时序性发育的lin-4。2000 年，Reinhart 等发现了另一个具有转录后调节功能的小分子RNA：let-7。随后的几年时间里，许多研究人员相继发现了这类 RNA。目前，在各物种中共发现4,449个miRNA，其中在人类中发现并已经得到实验证实的有 474 个。这些miRNA的功能主要是调节生物体内与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，对 miRNA 的深入研究，势必有利于我们对生物体生理、病理机制的理解，并为疾病的诊断和治疗提供理论基础和新思路。1 1 miRNA的发现 1993年Lee等在对秀丽新小杆线虫(C. elegans)进行突变体的遗传分析中意外发现一种控制细胞发育时序的长度约为22 nt的小分子非编码单链RNA-lin-4；2000年Reinhart等在线虫中发现了另一种重要的具有转录后调节作用的miRNA-let-7。lin-4和let-7即是首先被确认的miRNA，它们通过部分序列结合到目的miRNA靶的3UTR，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，通过调控一组关键mRNA的翻译调控线虫发育过程。随后对miRNA的研究不断增加，多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA，预计大约有1 000 种人类miRNA参与近三分之一人类蛋白编码基因的调控。21.1 定位克隆目前，已知的 miRNA基因多是通过定位克隆的方法发现的。定位克隆 miRNA分子的简要步骤：细胞裂解，获得总RNA；变性胶分离并纯化1925 nt的小RNA；小RNA分子通过分离、纯化与3和5寡聚核苷酸接头连接；进行RT - PCR获得cDNA；cDNA连接载体，构建 cDNA文库；筛选克隆进行测序，获得miRNA序列。该方法常受其他小分子(如 siRNA)的影响，易产生假阳性。31.2 生物信息学方法生物信息学方法是依据成熟的miRNA基因(具有较大的序列同源性以及前体的茎环结构)在种属间具有高度的保守性特点，以某些 miRNA基因保守结构的特点为基础设计计算机程序，扫描基因组序列以鉴定潜在的 miRNA基因的方法。该方法根据比较基因组学原理并结合生物信息软件，以序列为基本框架在不同种属间进行序列比对，找寻可能的 miRNA基因。根据同源性的高低再进行 RNA二级结构预测，将符合条件的候选 miRNA基因与已经通过试验鉴定的 miRNA分子进行比较分析，最终确定该物种miRNA的分布及数量。Xie X等人在人、小鼠、大鼠和狗的基因组比对分析中指出，3- UTR存在大量的调节结构域，且近一半的调节结构域与miRNA有关。其中 miRNA 5端的 28个核苷酸为“种子区”，其对于miRNA与 3- UTR的配对非常重要。miRNA的“种子区”能很好地与靶序列配对，靶序列在不同物种中通常十分保守，“种子区”在同源的miRNA中很保守。因此，可用“种子区”序列预测未知的miRNA基因。目前，国际上计算机分析工具已被广泛地应用于许多物种候选基因的筛选。它们鉴别出的基因中有相当一部分都在试验中得到验证，这一方法由于灵敏度高，也已被应用于人类miRNA基因的寻找。生物信息学与生物芯片及定位克隆技术相结合也可预测miRNA基因，Bent wich I等通过计算机在整个人类基因组中筛选出一些可折叠为发夹结构的序列，从40多万个潜在的miRNA中挑选了首批5300个“代表 ”，借助高通量生物芯片在胎盘、睾丸、胸腺、前列腺和脑组织中进行筛选，发现其中有 886个表达，通过选择其中 359个进行克隆与测序，研究者们鉴别出89种新的 miRNA，从这些结果中推断人类基因组中至少有800个miRNA。32 miRNA的特征和作用机制2.1 miRNA的特征 研究表明，miRNA有以下几个明显特征：miRNA是一种长度为1925 nt的单链小分子，广泛存在于真核生物中，是一组非编码短序列 RNA，其本身不具有开放阅读框架 (ORF)，但在3端可以有12个碱基的长度变化，对 miRNA的具体长度范围尚无统一标准，在拟南芥和烟草中发现的26 nt RNA，在四膜虫( Tetrahym enas)中发现的能使大部分 DNA失活的28 nt RNA也被归于其中；其前体具有发夹或折叠的二级结构，不含有大的内部环状结构和突起，且成熟的miRNA应位于发夹结构的颈部；1miRNA能够互补配对结合于基因序列的侧翼区域，成熟的lin - 4和let - 7与靶mRNA的3非翻译区互补结合可抑制靶mRNA的翻译；由核酸酶 Dicer作用于前体的双链而生成的产物含有3羟基和5磷酸的核苷酸片段，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能 RNA的降解片段区别开来；大多数miRNA基因以基因簇形式存在于基因组中，它们多以顺反子的形式转录出前体转录本，且大部分位于独立的转录单位中，人类 miRNA基因分布于除 Y之外的所有染色体中；miRNA在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。约 12%的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性。序列比较发现这些保守序列只有 12个碱基的差异，mir - 1、mir - 34和 mir - 87在无脊椎动物和脊椎动物中高度保守。32.2 miRNA的作用机制已知动物miRNA靶基因中miRNA的结合位点通常有多个，例如lin-14基因有7个靶点，并且总在3-UTR。然而，这对发现动物miRNA结合位点可能有偏颇， 因为这主要建立在使用仅有3-UTR序列构成数据库的计算机预测基础上，这些结合位点的数量和互补性可能与翻译减弱的程度有关。如果仅有一个位点结合，表达减弱；但是如果所有位点都结合，翻译就完全抑制。实际上协同翻译抑制已经通过在3-UTR添加多个结合位点而得到证实。再者翻译抑制具有可变的调节性和可逆性，即miRNA从结合位点移去miRNA又可翻译。相反，在编码区裂解就永久破坏了mRNA，产生了只有mRNA重新转录才能逆转的彻底抑制。miRNA转录后抑制的确切分子机制在很大程度上仍然未知。 研究的最好例子之一是lin-4，它通过翻译抑制负调控靶基因lin-14。lin-4和lin-14碱基配对对其在体内的相互作用非常关键，因为影响它们互补的突变体会减弱或丧失该负调控作用。令人感兴趣的是lin-4仅抑制lin-14蛋白的合成，而不影响lin-14mRNA的合成丰度。而且，在存在lin-4的情况下，lin-14翻译起始似乎正常发生，因为即使lin-4表达，lin-14mRNA仍能有效地形成多聚核糖体。因此，推测lin-4翻译抑制发生在翻译起始后，可能在翻译延伸和（或）lin-14蛋白释放过程。靶基因的翻译抑制并不是lin-4所特有，目前研究表明，在整个动物界，靶基因的翻译抑制是通过miRNA负调控其靶标的主要调控机制。尽管大多数动物 miRNA抑制靶基因的翻译，然而，一个新发现的哺乳动物miRNA-miR-196，与其靶标Hoxb8几乎完全配对，直接介导鼠胚胎和培养细胞中Hoxb8mRNA的裂解。所以，miRNA与目的基因的作用方式有2种，miRNA以何种方式与目的基因作用，同miRNA与目的基因的配对程度有关。miRNA 与目的基因不完全配对时， 就以抑制目的基因翻译的方式作用；miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。43 miRNA与疾病的关系3.1 miRNA与肿瘤的关系3.1.1 miRNA与肿瘤的发生发展目前已经识别和鉴定的人类miRNA 序列有321个，其中 234个被实验证实。多数miRNA定位在与肿瘤相关的染色体部位，miRNA的异常表达与特定肿瘤有关，可以调控重要的肿瘤相关基因，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭或血管形成等过程。这些迹象表明，miRNA在人类肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。5认为， miRNA在肿瘤发生中的作用主要在于3个方面：(1)有些编码 miRNA的基因可能起着癌基因的作用；(2)有些 miRNA基因则可能起到抑癌基因的作用；(3)一些致瘤病毒编码的miRNA也可能参与相关肿瘤的发生。6以往的研究发现蛋白编码基因的异常会导致肿瘤的发生发展，自2002 年11 月Croce研究组首次报道miRNA异常与肿瘤相关，越来越多的证据显示miRNA在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。有关miRNA的研究，为更全面深入地了解肿瘤的发病机理提供了新的思路。7多个研究小组利用microarray和磁珠杂交技术发现良性和恶性肿瘤中miRNA 的表达水平发生改变，但是miRNA表达水平的改变是肿瘤发生的“因”还是“果”尚不清楚。相对于正常组织，有些miRNA 的表达水平在肿瘤组织中发生明显下调，如肺癌中的let-7；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的miR-15a/miR-16-1表达簇；结肠癌中的miR-143/miR-145。有些miRNA的表达水平则在肿瘤组织中发生明显的上调，乳头状甲状腺瘤、恶性胶质瘤中的miR-221/miR-222 ；睾丸生殖细胞瘤中的miR-372/miR-373 ；乳腺癌、肺癌中的miR-21；霍金森淋巴瘤、B细胞型淋巴瘤中的miR-155。8目前认为引起miRNA在肿瘤中表达水平发生改变的可能原因：(1)50的miRNAs 位于或靠近基因组中肿瘤相关的脆性区域，即经常发生缺失、扩增、易位的染色体片段，如在慢性淋巴细胞性白血病中表达降低的miR-15a/miR-16-1，位于肿瘤中经常缺失的13q14，在淋巴瘤中上调的miR-17-92表达簇，位于肿瘤中经常发生扩增的13q31；(2)由于异常甲基化造成的miRNA 转录水平的明显改变，如在前列腺癌、膀胱癌中的miR-127；(3)miRNA加工过程的关键蛋白的表达异常，如肺癌中Dicer表达水平的下调； (4)miRNA前体上的突变或多态影响miRNA的加工成熟：如miR-15a/16-1前体上游7bp的C/T多态位点，位于miR-125a成熟体的G/T 多态位点。肿瘤中常呈现蛋白编码基因的突变，至今为止只有两篇文献报道在肿瘤组织中检测miRNA前体序列的改变，其中Croce 小组在75 例CLL 中分析了42 个miRNA，共计在11 例样本中发现5 种miRNA胚系突变。我们实验室在96例肝癌组织中分析了59 个miRNA 前体序列，没有发现碱基突变。miRNA的突变是否与肿瘤的发生发展相关还需在更多的肿瘤标本上进行验证。83.1.2 miRNA与肿瘤的基因治疗miRNA通过与特定靶mRNA结合，负性调控靶mRNA的转录和翻译。通过补充 miRNA或使用抑制物调节靶 mRNA及其蛋白的表达，达到控制肿瘤恶性增殖和促进细胞凋亡的目的。miRNA作为重要的“肿瘤干涉基因”的出现对肿瘤的基因治疗具有很大影响。抑制 miRNA通常采用给予化学合成的、与成熟miRNA序列互补的反义寡核苷酸 ( anti-miRNA oli-gonucleotides，AMOs)的方法。近来人们开发出了一组拮抗 miRNA的药物，被称为“antagomirs”，如反义2-O- 甲基核苷酸 ( 2- O- methyl ) 和锁定核苷酸( locked- nucleic- acid) ，它们具有与天然 miRNA互补的序列。对小鼠静脉注射拮抗 miR-16、miR-122、miR-192和 miR-194的“antagomirs”，会使小鼠肝、肺、肾、心、小肠、脂肪、 皮肤、骨髓、肌肉、卵巢和肾上腺等组织中相应的 miRNA明显减少。这些小分子主要降低 miRNA的转化，比其他抗肿瘤药物更为稳定，并且毒性较小，可以有效的控制 miRNA在各个器官中的活动，从而发挥治疗作用。相反，通过补充与天然 miRNA序列相同的小分子可增强 miRNA的作用。Takamizawa等将合成的let-7补充到let-7低表达的肺腺癌细胞株 A549中，抑制 RAS蛋白的翻译，肿瘤细胞的生长明显受到抑制。这一方法的作用机制类似于 RNA干扰。目前RNA干扰技术是利用人为设计的一段小干扰RNA (即siRNA)来进行基因干涉，但人们发现，应用siRNA来进行肿瘤基因治疗会使机体产生较大的免疫反应。而miRNA序列来源于细胞基因组中，其序列相对固定，并且体内存在miRNA表达的调控机制，激活内源性miRNA机制可以导致正确的miRNA的加工和靶基因的抑制。因此miRNA的发现为肿瘤的基因治疗提供了更好的选择，miRNA药物有望成为更先进的RNA干扰药物。53.2 miRNA与心血管疾病的关系越多研究发现miRNA在生物发育过程中存在组织特异性表达，参与形成并维持组织特异性。有数十种miRNA在心肌细胞中被鉴定，例如：miR-133a、miR-133b、miR-1d、miR-296等，它们在心血管疾病中发挥重要作用。93.2.1 miRNA与先天性心脏病 (简称先心病 ) 在心脏发育过程中，Hand2是胚胎发育初级阶段扩增肌肉前体细胞的必需基因，该基因突变或缺失可导致心脏发育不良甚至使心脏停留在早期发育状态，尤其是第二心脏区域细胞 ( the second heart field) ，后者将分化为右室及流出道。Zhao等研究发现，miR-1可以适时阻止Hand2蛋白合成，调控心脏正常发育，此发现有助于了解干细胞增殖分化为心肌细胞的机制并为先心病诊疗提供新线索。93.2.2 miRNA与心力衰竭 miRNA是心肌细胞异常增生的潜在抑制物或加速剂。特定 miRNA表达上调，抑制心肌细胞异常增生从而阻止或延缓心脏重构的进程。表达下调，促进心肌细胞异常增生，加速心脏重构。10Van Rooij等应用并列 miRNA微点阵方法分析186种不同 miRNA在两种心肌肥厚鼠模型中的表达。其中，主动脉缩窄小鼠模型组(通过结扎胸主动脉造成心脏后负荷增加，建立肥厚心肌模型 thoracic aortic banding，TAB)与假手术组 (仅行开胸手术，不进行胸主动脉结扎)相比，有27种miRNA表达明显增加，15种表达降低。显著表达激活钙磷酸酶 A ( activated calcineurin A，CnA)小鼠模型组 (通过转基因技术使鼠心肌CnA过度表达，建立心肌肥厚模型)有33种miRNA 高于对照组 (CnA表达正常的同胞小鼠)，有14种表达降低。TAB组和CnA组上调的miRNA中有21种相同，下调的miRNA中有7种相同。该研究还发现 miR-195上调可诱发心肌细胞肥大，从而确定了miRNA在心肌肥大、心力衰竭发病过程中的调节作用。利用病毒或脂质体将具有逆转心脏重构功能的miRNAs引入机体内，或利用抗 miRNA 寡聚核苷酸 ( 2- O-methyl- modified antisense oligoribonucleotides，AMOs)灭活促进心脏重构的 miRNAs，均可延缓或逆转心力衰竭的进程。Kru等使用 antagomirs (与胆固醇耦联的AMO)注入小鼠体内后，可有效抑制多个器官 miRNA活性，可能成为一种有希望的治疗药物。miR-208是一种心脏组织特异性表达的 miRNA，在心肌细胞增生、纤维化及调节-心肌肌球蛋白链 (-myosin heavy chain，-MHC)表达中发挥作用。miR-208由-心肌肌球蛋白链 (- myosin heavy chain,-MHC)基因编码，后者可以促进心脏收缩蛋白的生成，调节心肌增生。miR-208正常表达的小鼠心脏发生损害，而缺乏miR-208表达的小鼠则表现健康，-MHC纤维含量减少。因此，miR-208可能成为治疗心力衰竭的新靶点。93.2.3 miRNA与心律失常 Yang等发现 miR-1可以通过作用于KCNJ2和 GJA1减慢传导，促使细胞膜去极化。小鼠心脏内过量表达 miR-1可以导致心律失常，通过反义寡核苷酸移除 miR-1后，梗死小鼠心律失常明显缓解。因此，miR-1有望成为心律失常的治疗靶点。超极化激活环化核苷酸调控阳离子通道基因 (Hyper polarizati on- activated，CyclicNucleotide- gated channels，HCN)，是“ 内源性 ” 起搏通道基因 ，在舒张期选择性激活，存在较大的潜在起搏能力。其中HCN2主要分布于心脏和脑组织， HCN1和 HCN4除分布于脑组织和心脏外，还分布于窦房结。在Sp1促进 HCN2 /HCN4转录翻译的同时，miR-133和 miR-1明显限制 HCN2 /HCN4蛋白的表达。两种不同方式的调节决定了在不同生理及病理条件下 HCN2 /HCN4的功能水平。移除任何一种miRNA都不能转复由现存miRNA所引起的基因抑制，表明HCN2受 miR-133和 miR-1两者共同作用。Xiao等研究发现：通过反义寡核苷酸技术减少内源性 miR-1和 miR-133可使 HCN2 /HCN4表达有效增加，有望研制出生物起搏器。HERG基因异常将导致心肌内向整流性钾通道功能异常，使3相复极延长而导致长QT综合征 (LQTS)。miR-133可以作用于HERG基因导致该基因表达异常，因此应用反义寡核苷酸技术抑制miR-133，可以增加正常HERG基因表达。进而达到治疗 LQTS的目的。93.3 miRNA与糖尿病的关系miRNA研究将为治疗糖尿病提出新途径，Rockefeller大学研究人员最近报道了一项对新发现miRNA基因的研究，揭示出它具有调节胰腺中胰岛素分泌的功能。此发现第一次确定了一个哺乳动物miRNA基因的生物功能。新研究中研究人员发现miR-375能够调节胰岛素分泌。11Nikolaus Rajewsky研制出一种能够预测基因组中miRNA 的靶标的计算机程序。在此项研究中，他们利用这个程序预测miR-375的基因靶标通过实验被证实，并因此了解到miR-375在调节胰岛素分泌中的功能。此项研究为了解机体如何调节胰岛素分泌过程开辟了新路，并可能为糖尿病的治疗奠定基础。而且，这些发现首次定义了一种哺乳动物miRNA 基因的生物功能。研究还表明计算机方法和实验的紧密结合是“后基因组时代”的生物学研究不可或缺的策略。23.4 miRNA与阿尔茨海默病的关系如今，许多研究已经专注于miRNA在不同疾病中表达的改变，最近发现表明miRNA是神经退行性变的促成因素。12研究发现在阿尔茨海默病（AD），甚至在疾病恶化最初阶段的病人上miR-107表达水平明显下降。miR-107也许通过靶向作用淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（BACE1）涉及加速疾病过程，BACE1是一种裂解骨髓前体蛋白到产生神经毒性淀粉样蛋白肽的内肽酶。miR-107与BACEmRNA的3UTR连接，下调BACE的表达。miR-107的缺失导致疾病中BACE水平的增加，这些通过miRNA分析，昂飞微数列、生物信息学预测和原位杂交被证明。因此，这种蛋白质的调节异常也许在AD的发病机制中起到重要作用。在以前的工作中，Lukiw通过检查胎儿、成人和阿尔茨海默病人脑的海马区域的miRNA的丰度，发现一些miRNA的表达在不同病理阶段被不同地调节。特别地，与年龄相一致的成人比较，miR-9，miR-125b和miR-128在AD病人的脑中上调。133.5 miRNA与帕金森病的关系miRNA可能也和帕金森疾病相关，14最近一项研究调查它们在哺乳动物中脑多巴胺能神经元（DNs）的作用和鉴定miR-133b在DNs作为特定的表达，但是在帕金森病人的中脑组织中非常少或缺乏。miR-133b通过下调对等相似的同源结构域转录因子Pitx3的表达的机制调节成熟作用和中脑DNs的功能。此外，在哺乳动物和无脊椎动物的研究已经显示miRNAs涉及神经保护，脆性X染色体综合症和精神分裂症。133.6 miRNA与艾滋病的关系近年研究发现，miRNA 与产生艾滋病的人类免疫缺陷病毒（HIV）有着紧密联系。15最新研究中发现miRNA产生过程可与HIV生活周期以及肿瘤的抑制相关联。负责对miRNA进行加工的3个蛋白中有2个就是早期负责制造miRNA的蛋白，而发现的第3个蛋白也不是未知的蛋白，而是早已引起科学家注意的蛋白TRBP（TAR RNA-binding protein），它是在研究HIV转录时第1次被发现，同时它也被确定是一个肿瘤抑制蛋白。TRBP的发现表明RNA干涉可能在HIV复制时起到关键作用。 由于TRBP与肿瘤之间密切相关， RNA干涉与肿瘤的关系有待进一步探索。24 小结与展望自从15年前miRNA被发现，它们已经被公认作为转录调节的介导。这篇综述讨论了它们在许多疾病中的作用。提出超过三分之一的人类基因在miRNA的控制下，这解释了它们在疾病中的广泛作用。miRNA在肿瘤、心血管疾病和糖尿病等多种疾病中的重要作用正引起各国研究者广泛关注，miRNA与各种疾病关系的研究正在如火如荼的进行。寻找调控的miRNA 基因以及miRNA 的靶基因，揭示miRNA在各种疾病中的作用机制仍是摆在科学家们面前的主要问题。相信随着对这种特殊分子的深入了解，一些以miRNAs为靶点的新药物会不断出现，不但有助于认识生命过程， 而且将为肿瘤和其它疾病的治疗带来新的希望。参考文献1 盛熙晖,杜立新. MicroRNA及其在人和动物上的研究进展J. 遗传, 2007, 29(6): 651658.2 夏洪平,马跃东. microRNA前景光明的药物开发新靶点J. 食品与药品, 2006, 8(09A ):19-21.3 索效军,张年. microRNA的研究进展J. 黑龙江畜牧兽医, 2007, 12:24-25.4 郑玉姝,赵朴,赵宏坤. microRNA及其应用前景J. 生物技术通讯,2007,18(1):119-121.5 宋宝,宋现让,魏玲. microRNA与人类肿瘤J. 基础医学与临床,2007,27(10):1181-1184.6 宋莉,王泽. MicroRNAs的研究方法学及其与肿瘤发生发展关系的研究进展J. 中国肿瘤生物治疗杂志,2007,14(4):397-400.7 Dillhoff M., Wojcik SE, Bloomston M. MicroRNAs in Solid TumorsJ.