03 轮腺综述资料120727.doc

轮状病毒/腺病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）综述资料一、选题目的婴幼儿腹泻病是世界范围内影响儿童健康的常见病和多发病。病毒性腹泻是导致全球儿童急性重症腹泻的重要原因，此病也是发展中国家小儿死亡的主要疾病。全世界每年因轮状病毒（Rotavirus，ROTA）感染导致的婴幼儿死亡的人数大约为900000人，其中大多数发生在发展中国家。在我国，02岁以内的婴幼儿人数约为4000万人（含新生儿），每年大约有1000万婴幼儿患轮状病毒感染性胃肠炎，占婴幼儿人数的1/4。轮状病毒是引起婴幼儿严重腹泻的最主要病原。肠道腺病毒(enteric adenovirus，EAdv)是20世纪80年代发现的一种新的导致婴幼儿腹泻的主要病原。近年来的研究表明EAdv在免疫缺陷患儿中可增加发病率和延长住院时间 ，国内外有暴发或流行的报道。许多国家已将EAdv的检测列入腹泻病的常规检查。但我国目前对EAdv的基础、临床及流行病学的研究还比较缺乏。近年来，随着临床检测技术的提高，对其研究不断深入，其危害性日益受到临床医生的重视。轮状病毒/腺病毒引起的腹泻均需要以补液治疗为主，与其他腹泻有明显的不同，抗生素治疗有害无益。轮状病毒/腺病毒胶体金检测试剂检测不需要任何仪器设备，通过对腹泻病人尤其是幼婴儿腹泻粪便的检测，可快速有效区分标本中的轮状病毒和腺病毒，以便临床及时进行有针对性的治疗。二、研究现状1症状表现轮状病毒肠胃炎是一种从温和到严重的疾病，有一些表征像是呕吐，水状腹泻，以及低程度的发热。当儿童受到这类病毒感染时，在症状发生前大约会有两天的潜伏期（incubation period）。症状通常是从呕吐开始，接着是四到八天的大量腹泻。轮状病毒感染较容易造成脱水的细菌性病原体还要更常引起脱水的现象，脱水成为轮状病毒感染的最常见的死因。 在人一生中，感染轮状病毒A种会有这样的经过：第一次感染通常会产生症状，但是下一次的感染通常会是典型的无症状，因为免疫系统提供了部分的保护机制。所以，感染症状发生的比例于两岁以下的儿童最高，之后渐渐降低直到45岁为止。虽然新生儿感染的机会很常见，但是通常都是温和的症状或是无症状疾病；最严重的症状都会发生在比较大一点的出生六个月到两岁的小孩，以及发生在有免疫缺陷的小孩身上。因为从童年获得的免疫力，大部分的成人对于轮状病毒并不易受到影响；成人发生的肠胃炎通常是因为其他病因而非轮状病毒，但是成人的无症状感染依然在社群中带有感染症的传染性。有症状的再感染通常因为感染了不同血清型的轮状病毒A种。 受到腺病毒感染时，症状潜伏期10天左右。主要症状是腹泻，呈水样便或稀便，量或多或少。儿童每天排便最多89次，病程一般48天。各型腺病毒所致腹泻持续时间不等，以肠腺病毒胃肠炎腹泻时间最长，大多患者有呕吐，持续12天，少数有发热。非肠型腺病毒腹泻患者发热较多。约20腺病毒肠炎患者有呼吸道症状。粪便排病毒时间1周左右。 腺病毒肠炎病情一般较轻，少数有严重脱水或同伴其他系统感染需住院治疗。2.实验室检查方法2.1 轮状病毒轮状病毒感染的诊断正常都是诊断出肠胃炎并且有严重腹泻的状况之后。大部分的因为肠胃炎进入医院的儿童病患都被检测出轮状病毒A种。对于轮状病毒A种传染病的专门诊断方式是对病患的粪便利用酵素免疫分析法去作病毒的识别。市场上已经有几种核准的监测设备，这些监测设备对于轮状病毒A种的所有血清型都可以敏感，个别的检测出来。其他的检验方法，如电子显微镜法或是凝胶电泳法，则是使用在研究实验室之中。逆转录聚合酶链锁反应（RT-PCR）可以检测并识别所有种与所有血清型的人类轮状病毒，但是这些方法对设备要求较高，受场地限制较大。而胶体金免疫层析快速检测法可以快速、方便地实现对临床粪便标本中轮状病毒抗原的特异性检测。2.2 腺病毒(1) 电镜和免疫电镜：电镜直接观察标本中腺病毒颗粒，粪便中病毒颗粒多，形态独特，易于辨认，但不能分型，且要求条件高、费时、灵敏度不高，不适用于流行病学调查。免疫电镜技术的运用提高了检测灵敏度，并且能区分不同的血清型。(2)细胞培养：EAdv可在张氏结膜细胞、Craham293、HT-29、Hep-2、第3代食蟹猴肾细胞中生长，但只有Craham293细胞对EAdv有较高的易感性。(3)血清学实验： 中和试验：是检测腺病毒的经典方法，可对腺病毒分型，但该法需要的病毒量大，需用特异性抗体；补体结合试验：不能确定腺病毒基因的特异性；血凝抑制试验(HIA)：测定EAdv的特异性较高，但不能对其进行分型。(4)免疫学实验： 酶联免疫吸附试验(ELISA)：试验的特异性和敏感性较高且快速、特异、操作简便，与HIA联合用于检测EAdv及对腺病毒进行分型； 免疫斑点法(DIA)和免疫亲和层析：这两种方法均比ELISA 和IFA更为简便快捷、经济且易于推广，适用于腺病毒性腹泻患者的快速诊断及其流行病学调查 。(5)分子生物学检测方法：DNA分子杂交法：可用于EAdv的检测和分型，该法特异性高，不依赖细胞分离病毒，诊断迅速，但DNA探针制备过程复杂，技术要求高，且标记物的半衰期短； 基因电泳：取粪便标本提取腺病毒DNA，用限制性内切酶消化后进行琼脂糖电泳，Ad40和Ad41型可出现独特的酶切图谱。 聚合酶链反应(PCR)：简单、快速，灵敏度和特异性都较高。其中荧光PCR(realtime PCR)是目前比较先进的检测方法，在传统PCR的基础上加上了荧光探针技术改善了结果的特异性和敏感性，并可以对检测物质进行量化，该方法现已用于对EAdv检测。总之，上述几种方法中胶体金免疫亲和层析法是最方便、最快捷的，设备要求最低，可以满足各层次医院对肠道腺病毒进行初步诊断，其检测结果与临床符合率较高，从而可以帮助腺病毒感染疑似症状的患者尽早建立相应治疗方案。三、产品描述1. 原理胶体金免疫检测技术是目前临床快速检测常用方法之一，以胶体金为标记物，产生肉眼可见的试验结果，简单实用，快速便捷，且不需要特殊的仪器设备。英科新创公司利用自身多年生产体外检测试剂的优势，开发了轮状病毒/腺病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）生产技术。本品采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，通过双抗体夹心法检测原理来定性检测人粪便样本中出现的轮状病毒抗原和腺病毒抗原，分别在硝酸纤维素膜上的检测线A处包被腺病毒抗体，检测线R处包被轮状病毒抗体，在对照线C处包被羊抗鼠IgG，在玻璃纤维上包被轮状病毒单克隆抗体和腺病毒单克隆抗体胶体金混合物。测试时，样本与预包被的胶体金颗粒标记单克隆抗体反应，然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，在（R）测试区或（A）测试区或在这两个测试区同时出现紫红色条带，则是表明轮状病毒阳性或腺病毒阳性或者两者都为阳性。若标本中不含有相应的待测物，则（R）测试区或（A）测试区内没有紫红色条带，则表明是腺病毒或轮状病毒为阴性。无论样本中是否存在待测物，一条紫红色条带都会出现在质控区（C）内。质控区（C）内所呈现的紫红色条带是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。2. 主要原料本产品所用主要原料包括：抗Rotavirus-mAb2（包被用），抗Rotavirus-mAb1（标记用），抗Adenovirus- mAb2(包被用），抗Adenovirus- mAb1(标记用）和羊抗鼠IgG（包被对照线）。从筛选的合格供方处购入蛋白浓度、纯度、活性均符合设计要求的原料。单克隆抗体均用SDS-PAGE蛋白电泳法测定纯度，用福林-酚法测定蛋白含量；用SDS-PAGE蛋白电泳法测定蛋白纯度。要求抗Rotavirus-mAb2的蛋白含量不低于1.0mg/ml，抗Rotavirus-mAb1蛋白含量不低于1.0mg/ml，抗Adenovirus- MAb2蛋白含量不低于1.0mg/ml，抗Adenovirus-mAb1的蛋白含量不低于1.0mg/ml。羊抗鼠IgG蛋白含量不低于2.0mg/ml。要求蛋白纯度均不低于90%，用免疫双扩散法测定活性。同时，对其所生产产品进行检测，确定灵敏度、特异性均满足产品标准要求。3. 主要生产工艺过程(见下页)进料及检验 半成品生产 成品组装及检验1. NC膜2. 对照线原料3. 检测线原料1. 聚酯板支架2. 吸水纸3. 标签4. 其他辅助材料1. 氯金酸2. 柠檬酸三钠3. BSA4. 原料（抗原/抗体）5. 样品垫金标抗体的包被：1. 胶体金制备： 1%氯金酸（HAuCl4）水溶液4g加入至98g纯水中，加热至沸腾，加入沸腾后的2%柠檬酸三钠2g，混匀，煮沸3-5分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却即可。2. 活性原料的金标记：按照使用浓度将抗原/抗体加入胶体金中。加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟（4000转），吸去上清，沉淀以金标抗体缓冲液重新悬浮。3. 按特定的稀释度比例金标记包被于玻璃纤维上，干燥。NC膜的包被：1. 检测线包被：蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，包被浓度1.0mg/ml2. 对照线包被：蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50/20min，包被浓度1.0mg/ml成品组装检验成品放行4.质控品4.质控品制定企业质控品，对半成品的性能方面指标进行检测，性能方面包括灵敏度、特异性、均一性、稳定性等；对成品进行物理检查（包括外观、材料附着、液体移行速度、膜条宽度）和性能检测，稳定性也均应符合性能质量标准。四、生物安全性方面的说明本试剂盒仅供体外诊断使用，试剂盒在检测线R处包被抗Rotavirus-mAb2，检测线A处包被抗Adenovirus-mAb2，在对照线处包被羊抗鼠IgG，配以胶体金标记抗Rotavirus-mAb1和抗Adenovirus-mAb1，本试剂盒不具传染性。按照生物制品规程相关要求，在产品使用说明书的注意事项中关于操作安全进行了以下说明：对于那些含有感染源和怀疑含有感染源的物质应有合适的生物安全保证程序，下列为有关注意事项但不仅限于此：带手套处理样本和试剂、不要用嘴吸样、不可在处理这些物品时吸烟、进食、喝饮料、美容和处理隐形眼镜、用消毒剂对溅出的样本和试剂进行消毒、按当地的有关条例来消毒和处理所有标本、试剂和潜在的污染物、试剂各组份在正当处理和保存的情况下直至效期都保持稳定，不能使用过效期的试剂盒。五、与市场上同类产品的比较国内已有厂家生产轮状病毒/腺病毒抗原检测试剂盒（胶体金法），如艾康生物技术（杭州）有限公司于2010年获得文号。本公司试剂与对照试剂检测结果具有高度的一致性，满足临床定性快速检测要求，适用于临床轮状病毒抗原及腺病毒抗原的定性检测。参考文献1. SCHMITZ, H. et al. 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