蛋清卵类粘蛋白的分离纯化.doc

蛋清卵类粘蛋白的分离纯化一实验器材1.仪器 ：pH计、恒温磁力搅拌器、蛋白质核酸分析仪、自动部份收集器、梯度混合器、层析柱、紫外可见光分光光度计 、真空冷冻干燥机、电泳仪、电泳槽、恒温震荡摇床、透析袋、冷冻离心机、 真空干燥箱、分析天平2.试剂：新鲜鸡蛋、Sephadex G-25凝胶填料、DEAE-32纤维素离子交换填料、卵类粘蛋白标品、三氯乙酸(TCA)、丙酮、氯化钠、NaH2P04、Na2HP04、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、丙烯酰氨、过硫酸胺、甘氨酸、Tris-base、十二烧基硫酸钠、乙醇 、冰醋酸 、碳酸氧钠 、氯化铁 、硫酸胺3.主要溶液的配制及材料的处理：10%三氯醋酸(pH 1.15): 先把称好的TCA加总体积2/3的水溶解,再用10 mol/LNaOH调节pH至1.15,最后加水至所需体积。0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液: 先配成10倍的母液,用时稀释至0.02 mol/L;磷酸氧二钠-磷酸二氧钠缓冲液(0.02 mol/L, pH 6.5, 25）配制方法:0.2 mol/L 磷酸氢二钠:Na2HP04 12H20 71.64 g/1000 mL, 31.5 mL;0.2 mol/L 磷酸二氧钠:NaH2P04 2H20 31.21 g/1000 mL, 68.5 mL;胰蛋白酶标准液(0.5mg/mL): 用0.001 mol/LHCl配制(每次50ml,用完再配);BAEE 底物缓冲液(内含 0.05 mol/L CaCb): 用 0.05 mol/L 的 Tris-HCl 溶解,调pH至7.8;1 mmol/L BAEE底物溶液: 34 mg BAEE定容至100 mL底物缓冲液中,临用前配置。Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析填料的处理: 称取30 g Sephadex G-25,用0.02mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液500 mL热溶胀2 h或者室温溶胀24 h。脱气后装柱。DEAE-32纤维素离子交换填料的处理: 称取DEAE-纤维素粉(DE-32) 10 g,以150 mL 0.5 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCl溶液浸泡20 min,转移到布氏漏斗中抽滤,用蒸馏水洗至中性(大约pH8.0),抽去水分,移至烧杯中,再用150 mL 0.5 mol/LHCl浸泡20 min,然后移至布氏漏斗中抽滤,以蒸馈水洗至中性(大约pH6.0)。最后倒在烧杯中用150 mL 0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液浸泡片刻。于真空干燥器内脱气,装柱。二实验方法1. CHOM粗品的制备1.1 TCA沉淀杂蛋白取50mL鸡蛋清,加等体积的10%三氯醋酸(pH 1.15)溶液,这时出现大量的白色沉淀,搅拌均匀后在pH酸度计上检查pH值,此时的pH值应是3.5。若提取液的pH值偏离pH 3.50.2,则要用5 mol/L NaOH或5 mol/L HCl把pH值调回到pH3.50.2的范围以内。由于提取液非常粘调,要防止局部过酸或过碱。调好pH值后,在室温下静置4 h以上。1.2离心去除杂蛋白沉淀待清蛋白完全沉淀后,以3000 r/min离心10 min。弃去沉淀物,上清再用滤纸过滤。以滤除上清液中的脂类物质及其他不溶性物质。1.3冷丙酮沉淀CHOM粗品收集滤液转移到一个烧杯里。检查滤液的pH值是否是pH 3.5,若相差较大要调回到pH 3.5。放置冰浴中冷却片刻,缓慢加入3倍体积的预冷丙酮(放在冰箱的冷藏室预冷)。用玻璃棒轻轻揽匀。用塑料薄膜盖好,尽量减少丙酮的挥发。在冰浴里放置4 h以上。1.4离心收集CHOM粗品并除残留丙酮待CHOM完全沉淀后,以4000 r/min离心5 min,倾出上清夜。将沉淀物放在真空干燥器类,抽气除去残留丙酮。然后用20mL蒸馏水溶解(若溶解液浑油,则用滤纸除去不溶物),即得CHOM粗提液。2. Sephadex G-25 层析柱脱盐取20 mL CHOM粗提液上柱脱盐(上样量不超过柱床体积的1/6)。用0.02 mol/L,pH 6.5磷酸缓冲液平衡并洗脱。收集洗脱峰。3. DEAE-32纤维素离子交换法纯化CHOM将经Sephadex G-25脱盐的CHOM粗提液上柱吸附。用0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液淋洗去除杂蛋白。流出液在核酸蛋白检测仪上绘出稳定的基线。然后改用0.3 mol/LNaCl-0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液洗脱。并收集活性峰。4. CHOM纯品的制备4.1透析除盐将上述收集到的溶液全部装入透析袋内。用蒸馏水进行透析。间隔一段时间更换一次蒸傾水,直到用l%AgN03检查无氯离子为止。4.2调整透析液的pH及冷丙酮沉淀CHOM纯品将透析液转移到烧杯里,用1 mol/LHC1调节至pH 4.0,然后加入3倍体积的预冷丙酮。盖上塑料薄膜,在冰浴里静置4 h以上。4.3 CHOM纯品的离心和干燥待CHOM全部析出后,倾出上清,剩余的沉淀物于4000 r/min离心5 min。弃去上清夜,沉淀物干燥,就得到透明胶状物一CHOM纯品。5. 产品鉴定与纯度5.1 十二烷基硫酸钠-聚丙燭酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)浓缩胶浓度5%,分离胶浓度12%。样品(2mg/mL)溶于上样缓冲液,上样量10uL,浓缩胶电泳恒压80 V,分离胶电泳恒压120V。凝胶用50%乙醇和10%冰醋酸固定30 min, 0.1%考马斯亮蓝R-250染色30 min, 25%乙醇和8%冰醋酸混合液进行脱色。6.总蛋白含量测定以牛血清白蛋白为标准蛋白质,用考马斯亮兰法测蛋白质含量。具体操作步骤如下:6.1标准曲线的绘制取7只干净试管,编号,并胺照下表所示加入试剂、混匀,室温静置3min,以第一管为空白在595nm波长下测定读取吸光度值,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度为纵坐标绘图得标准曲线。 编号 1(空白) 2 3 4 5 6 7标准蛋白液加入量/mL - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.80.9 %NaCl 加入量/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝染液加入量/mL4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.