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Rt-PCR 实验步骤 一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l 2、枪头：1ml、200l、20l 3、匀浆管：5ml 4、枪头台：放置 1ml 吸头的一个，放置20l 吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100l 6、试剂瓶：2 个 60ml 的棕色试剂瓶（广口，带盖） 1 个 125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、1.5ml、20l 10、盐水瓶：250ml、500ml 各 2 个备用，一个装无水乙醇，另一个装 DEPC水 11、铝制饭盒：4 个 12、塑料小饭盒：1 个 13、大瓷缸：2 个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸：2 卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入 DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡 1DEPC过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡 DEPC） 三、试剂配制： 1、DEPC水：吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成 1DEPC水，剧烈震荡，放在棕色试剂瓶中静置 4 小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20保存（其中DEPC水需先高压） 3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制： 1、电泳缓冲液： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml 5TBE （贮存液） 再将 5TBE稀释 10 倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml 贮存液+450ml 水500ml 工作缓冲液 2、上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 FF 30%甘油 6缓冲液，4保存 五、琼脂糖凝胶的配制： 1、1.0%： 1.0g 琼脂糖+100ml 电泳缓冲液，微波炉中火 30 秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置 30-45min后现进行电泳。 2、1.5%: 同上，将琼脂糖的量改为 1.5g 六、需购置的 Rt-PCR 材料： （生工. Tel. 2236106.） Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00 dNTP: 1支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1支 110 -20 DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1 瓶 Invitrogen Life technologies 4 Marker: 10g 0.2g/ml 150.00 科威 （1543. 994. 697. 515. 377. 231） 七、引物合成 1、内参照： GAPDH 正义：5ACCACAGTCCATGCCATCAC3 反义：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3 -actin 正义：5CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3 反义：5TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3 2、par-4: 正义：5GGGACCTCGGAACTCAAC3 反义：5TGTATCTGCCTGGGACTG3 3、退火温度计算 2（A+T）+4（G+C） 正反义平均数，再上下波动度（4，或5） 4、引物各合成 5 OD，每 OD一瓶分装好 5、引物稀释： 加 DEPC水量为（l）= ? nmol / OD 管上所标 OD数100 是为 10p mol / l 浓度的引物溶液 八、PCR产物电泳 先将 1-10l 左右 PCR 产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30 分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。 九、几个注意点： 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？ 2、Rt 时，先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提前，打开离心机预冷。 TRIzol 法抽提总 RNA 细胞 1107 组织 100mg 加 1mlTRIzol 细胞用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块 匀浆（要彻底，后转至 EP 管） （组织匀浆量100mg 时分装 1ml/每 EP 管） 颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 加氯仿 1/5 体积（0.2ml）（必须按总体积的 1/5） 颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 4，离心 12000g，15 分钟 转上层水相（约 400l）于另一 1.5mlEP 管中 加等体积异丙醇（约 400l），混匀室温 10 分钟 4，离心 12000g，10 分钟 弃上清 加冰预冷的 75%乙醇（用 DEPC 水配）1ml 4离心 7500g，5 分钟 弃上清，空气干燥 5-10 分钟（不能完全干燥） 溶于 DEPC 水中至 20l（10l-20l） （可在 55-60水中，10 分钟助溶） 注： 1、RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则 DEPC 溶解 2、细胞组织加 TRIzol 匀浆后，可在-60放置至少一个月（甚至可一年以上） 3、RNA 在 75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年 两步法 RT-PCR （第一步：逆转录反应） 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23l(11.5l) Oligo(dT)15 0.05g/l 4l(2l) 0.005g/l (稀释 10 倍后用） 混匀，离心，70 5min 立即冰水浴，稍离心 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5 8l (4l) 1 dNTP 10mM 2l (1l) 0.5mM RNasin 40U/l 1l (0.5l) 20 M-MLV 200U/l 2l (1l) 200U 总体积40l（20l） 混匀，离心，42 60min 95 10min（破坏 MLV） 4保存 （第二步：PCR反应） 试剂 浓度 体积 终浓度 Taq Buffer 10 2l (5l_) 1 MgCl2 25mM 1.2l (3l) 1.5mM dNTP 10mM 0.2l (0.5l) 200uM 上游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmol 下游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmol cDNA模板 X (?) (1-10l) DEPC水 20l4.3lX Taq酶 2.5U/l 0.3l (1l) 2.5U/l 总体积20l(50l) 混匀 97，5 分钟 立即冰水浴 混匀