FAK反义寡核苷酸对卵巢癌细胞凋亡、黏附和侵袭性的影响.doc

FAK反义寡核苷酸对卵巢癌细胞凋亡、黏附和侵袭性的影响【摘要】目的观察黏着斑激酶的反义寡核苷酸对卵巢腺癌细胞株OVCAR-3凋亡、黏附和侵袭性的影响。方法实验分4组，反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组。用脂质体介导的方法，将黏着斑激酶的反义寡核苷酸转入OVCAR-3卵巢癌细胞株，应用流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测细胞的凋亡率，应用基质胶细胞黏附实验和Boyden小室法检测卵巢癌细胞的体外黏附和侵袭能力。结果ASODN组卵巢癌细胞的凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);ASODN组癌细胞与基质胶的粘附率与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);ASODN组癌细胞穿透Matrigel胶的细胞数目与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论抑制黏着斑激酶的表达能增加卵巢癌细胞株OVCAR-3的凋亡，并降低其黏附和侵袭转移能力。 【关键词】 黏着斑激酶;卵巢癌;侵袭;凋亡;粘附【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of antisense oligodeoxynucleotides (ASODN) of focal adhesion kinase (FAK) on the apoptosis，adhesion and invasion of ovarian carcinoma cell line-OVCAR-3.MethodsThe ASODN was transfected into OVCAR-3 cells with lipofectamine TM 2000 in the form of liposome-ODN complexes.The cell apoptosis was observed by flow cytometry with Annexin-V/PI dual staining.The cell attachment assay was carried out in a culture well pre-coated with matrigel.The adhesion and invasion of ovarian cancer in vitro were detected by matrigel cell adhesion testing and Boyden chamber method.ResultsThe apoptosis rate of OVCAR-3 cells treated with ASODN was increased significantly，as compared with that in control group (P0.05).The adhesion rate of OVCAR-3 cells in matrigel treated with ASODN was decreased significantly，as compared with that in control group (P0.05).The number of OVCAR-3 cells that penetrated the matrigel was decreased significantly，as compared with that in control group(P0.05).ConclusionThe inhibition of FAK expression can increase the apoptosis of ovary carcinoma cell line-OVCAR-3，and can decrease its adhesion and invasion ability.【Key words】FAK;ovarian carcinoma;invasion;apoptosis;adhesion卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，主要的死亡原因是转移，但是目前发生转移的机制尚不完全明了。黏着斑激酶 (focal adhesion kinase，FAK)是一种新近发现的酶类，临床研究显示其在多种人类肿瘤中均有表达，与肿瘤的生长、侵袭与转移特性关系密切1-4。我们尝试以FAK的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASODN)体外转染卵巢癌细胞系OVCAR3，观察其对癌细胞凋亡、黏附和侵袭能力的影响。1材料与方法1.1实验材料脂质体lipofectin 2000购自美国Invitrogen公司。Transwell小室购于美国Coming Costar公司。Matrigel胶购于BD Biosciences公司。1.2细胞培养人卵巢癌细胞系OVCAR-3购自上海细胞所，于含有10%小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，37、95%湿度及5%CO2的培养箱中连续培养。1.3寡核苷酸的转染FAK反义寡核苷酸5’-ATAATCCAGCTTGAACCAAG-3’及FAK正义寡核苷酸 5’-CAAAATAATGGCAGCTGCTT-3’均由上海生工生物工程公司合成，并经硫代修饰。应用LipofectamineTM 2000按产品说明书转染人卵巢癌细胞系OVCAR-3。1.4Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡实验分4组，每组4孔：反义寡核苷酸组(ASODN组)、正义寡核苷酸组(sense oligonucleotid，SODN组)、脂质体组、空白对照组。取对数生长期OVCAR-3细胞，将细胞用无血清、无抗生素培养基洗2遍，然后用上述培养液将细胞浓度调至1×106/ml，按每孔1×106接种于6孔培养板。用无血清、无抗生素培养基分别溶解反义链和正义链寡核苷酸，使其终浓度为900 nmol/L。将LipofectamineTM 2000和无血清、无抗生素培养液室温孵育5 min后，分别和反义链、正义链寡核苷酸混合，室温孵育20 min，将上述混合物加入6孔板的细胞中，每组设3个复孔，轻轻前后摇动，置于37、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，转染6 h后每孔加入20%体积小牛血清，于转染后48h，收集1×106细胞，用冰冷的PBS洗涤1次，4、500 g离心5 min，弃上清，用稀释的结合缓冲液重悬细胞，浓度5×105/ml，置于冰上。取100 μl上述细胞溶液，加入5 μl AnnexinV-FITC溶液，2.5 μl溶解的PI。置于冰上避光孵育10 min。向细胞溶液中加入150 μl冰冷的稀释的结合缓冲液。用流式细胞仪进行分析。1.5卵巢癌细胞系OVCAR-3黏附能力的测定实验分4组，每组4孔：ASODN组、SODN组、脂质体组、空白对照组。以基质凝胶(美国Sigma公司产品)均匀铺被6孔培养板，37 1 h，加入人卵巢癌细胞系OVCAR-3的单细胞悬液(1×106个/孔),37摇床以100 r/min振摇30 min。吸出上清液，再以PBS清洗3次，计数上清液及清洗液中未黏附细胞的数量。黏附癌细胞的百分比(%)计算方法为(癌细胞总数-未黏附癌细胞数)/癌细胞总数×100%。1.6卵巢癌细胞系OVCAR-3侵袭能力的测定实验分4组，每组4孔：ASODN组、SODN组、脂质体组、空白对照组。于Boyden小室下室加入RPMI-1640培养液，上下室间置8μmol/L微孔滤膜，膜上铺Matrigel,37 30 min。制备浓度为1×107个/L的癌细胞悬液，取200 μl加入Boyden小室上室，培养24 h。取出滤膜，拭去滤膜表面的残留癌细胞，95%乙醇固定，苏木素染色30 min,200倍光镜下计数侵袭至滤膜背面的细胞数。每次实验计数8个视野，取均值。1.7统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以x-s表示，多组间均数比较采用方差分析，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1FAK反义寡核苷酸组凋亡增加ASODN组癌细胞的凋亡率为(46.316.8)%，与对照组(17.72.0%)比较差异具有统计学意义(P0.05)。见图1。图1反义寡核苷酸对卵巢癌细胞系OVCAR-3凋亡影响2.2FAK反义寡核苷酸组癌细胞黏附能力下降ASODN组癌细胞与基质胶的粘附率为(319)%，与对照组(6512)%比较差异具有统计学意义(P0.05)。见表1。2.3FAK反义寡核苷酸组癌细胞侵袭能力下降ASODN组癌细胞穿透Matrigel胶的细胞数目为(468)个，与对照组(12628)个比较差异具有统计学意义(P0.05)。见表1。表1卵巢癌细胞系OVCAR-3与基质胶的粘附率及穿透Matrigel胶的细胞数目3讨论卵巢癌的耐药、侵袭和转移是其主要的致死因素，肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤、序贯的复杂过程。肿瘤细胞的迁移运动能力是肿瘤细胞侵袭转移的重要环节5。研究发现多种肿瘤细胞中粘着斑激酶活性显著增加，与肿瘤细胞生长及侵袭转移等生物学行为密切相关。粘着斑激酶属于胞浆内非受体蛋白酪氨酸激酶，位于细胞和细胞外基质结合部位整合素构成的灶性粘附复合体上，具有多种功能，与细胞的多蛋白信号系统的形成、生存和游走等有关6-9。朱晨芳等10研究发现，抑制FAK表达可有效抑制MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理的Transwell小室能力，提示可使MHCC97肝癌细胞穿膜侵袭活力下降。而关于FAK在卵巢癌凋亡、黏附和侵袭性中的作用尚无相关研究报道。本研究文首次探讨了抑制FAK对卵巢腺癌细胞株OVCAR-3的凋亡、黏附和侵袭性的影响，我们采用脂质体介导的方法，将FAK反义寡核苷酸转入OVCAR-3卵巢癌细胞株，结果发现转染反义寡核苷酸组的OVCAR-3卵巢癌细胞株凋亡率、与基质胶的粘附率及穿透Matrigel胶的细胞数目分别为(46.316.8)%、(319)%和(468)个，与对照组相比差异均具有统计学意义。而转染正义寡核苷酸组及脂质体组的OVCAR-3卵巢癌细胞株，无论是凋亡率还是与基质胶粘附百分比、穿过基质胶的数目与空白对照组比较均无统计学差异，提示通过反义寡核苷酸下调FAK的表达能增加卵巢腺癌细胞株OVCAR-3的凋亡，并抑制其黏附和侵袭能力。本实验中为增加FAK反义寡核酸的稳定性，将所用的反义寡核酸就采用了全硫代修饰。并采用脂质体途径进行转染，以往的研究发现该转染方法具有高效性和操作步骤简单的优点11。综上所述，本研究提示抑制FAK的表达能影响卵巢癌细胞的凋亡、黏附和侵袭转移能力。以FAK为靶点有可能为卵巢耐药逆转及降低其转移、侵袭力提供一条新途径。【参考文献】 1Agochiya M，Brunton VG，Owens DW，et al.Increased dosage and amplification of the focal adhesion kinase gene in human cancer cells.Oncogene,1999,18：5646-5653.2Cance WG，Harris JE，Iacocca MV，et al.Immunohistochemical analyses of focal adhesion kinase expression in benign and malignant human breast and colon tissues：correlation with preinvasive and invasive phenotypes.Clin Cancer Res,2000,6：2417-2423.3Rovin JD，Frierson HF Jr，Ledinh W，et al.Expression of focal adhesion kinase in normal and pathologic human prostate tissues.Prostate,2002,53：124-132.4Sonoda Y，Matsumoto Y，Funakoshi M，et al.Anti-apoptotic role of focal adhesion kinase (FAK).Induction of inhibitor-of-apoptosis proteins and apoptosis suppression by the overexpression of FAK in a human leukemic cell line，HL-60.J Biol Chem,2000,275：16309-16315.5Sieg DJ，Hauck CR，Schlaepfer DD.Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration.J Cell Sci,1999,112：2677-2691.6Steinmller L，Cibelli G，Moll JR，et al.Regulation and composition of activator protein 1 (AP-1) transcription factors controlling collagenase and c