扫描电镜的结构与操作.doc

扫描电镜的结构与操作透射电子显微镜与光学显微镜一样，照明束穿过样品経过透镜的放大后，整个像是同时形成的。而扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，简称扫描电镜或SEM)则以完全不同的方式成像。其基本要点是：用极狭窄的电子束去扫描样品，即电子束在样品上作光栅运动。电子束与样品相互作用将会产生各种信息，例如样品的二次电子发射，发射出来的电子称为二次电子。使用我们下面将讨论的方法，二次电子能产生样品表面放大的形貌像。这个像是在样品被扫描时按时序地建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大的像。 早在1935年，透射电镜发明后不久，Knoll就提出利用一个扫描电子束从固体表面获得图像的原理。但由于技术上的原因，直至1965年扫描电镜才成为商品而被利用。此后，由于扫描电镜具有许多优点，使它在许多学科包括生物学的各个方面获得广泛的应用，成为极有价值的工具。 结构扫描电镜主要是由电子光学系统和显示单元组成，电子光学系统也称为镜筒，它的外观与透射电镜的镜筒相似，实际上相当于透射电镜的照明系统(SEM不需要成像系统)，它是由电子枪、几个磁透镜、扫描线圈以及样品室组成(见图2-1) 电子枪与透射电镜的电子枪基体相同，只是加速电压较低，一般在40kV以下。磁透镜一般有三个：第一、二聚光镜和物镜，其作用与透射电镜的聚光镜相同：缩小电子束的直径，把来自电子枪的约30m大小的电子束经过第一、二聚光镜和物镜的作用，缩小成直径约为几十埃的狭窄电子束。这是因为扫描电镜的分辨率主要取决于电子束的直径，所以要尽可能缩小它,为此物镜还装备有物镜可动光栏和消散器。 一个带有扫描电路的偏转线圈通以锯齿波的电流，产生的磁场作用于电子束上使它在样品上扫描。扫描的区域、扫描速率和每厘米的扫描线数都可以选择。这个电路同时输送锯齿波电流给显示部分的显像管(CRT)的偏转线圈，所以镜筒的电子束与显像管的电子束是严格同步的。出于与透射电镜同样的理由，镜筒也是被真空系统排气至高真空，一般为10-3Pa的真空度。扫描电镜的真空系统也与透射电镜的真空系统相似，由机械泵、扩散泵、检测系统、管道及阀门等组成。样品室位于镜筒的底部，样品放于样品台上，样品台带有使样品移动(前后、左右、上下)、倾斜和旋转的控制杆。为了能观察大块样品，样品室是大于透射电镜的。与透射电镜一样，扫描电镜的镜筒也有一套合轴调整装置，但相对比较简单。 显示单元包括信号的收集、放大、处理、显示与记录部分(见图22)。信号的收集是由探测器(或称收集器,见图23)完成，二次电子的探头是一个闪烁片，这是一个圆形玻璃片，其上镀有约0.07m厚的铝导电层，在导电层上加上+10kY的高压。入射电子射到样品上引起的二次电子发射,二次电子被高压吸引射到闪烁片上使其发光，在闪烁片后面接上一光导棒，用它把闪烁片产生的光信号送到它后面的光电倍增管。经光电倍增管放大接到后面的前置放大器和视频放大器，最后接到显像管的栅极。 显示和记录部分包括两个显像管和照相机。一个显像管是长余辉的，用于观察，另一显像管是高分辨率的、短余辉的，用于照相。为了完成聚焦、消散以及放大率，视野和加速电压的选择以及反差与亮度的调节，需一系列的电路以及相应的调节旋钮。 编辑成像原理扫描电镜的工作过程是这样的：从电子枪灯丝发出的直径约2035m的电子束，受到阳极的140kV高压的加速射向镜筒，并受到第一、二聚光镜(或单一聚光镜)和物镜的会聚作用，缩小成直径约几十埃的狭窄电子束射到样品上。与此同时，偏转线圈使电子束在样品上作光栅状的扫描。电子束与样品相互作用将产生多种信号，其中最重要的是二次电子。各种信息的探测要用不同的探测器，二次电子探测器如上所述，二次电子能量很低(小于50eV)，受到闪烁片上的高压(+10kV)的吸引而加速射向闪烁片，闪烁片受到二次电子的冲击把电子的动能转变成可见光，光通过光导棒送到光电倍增管，在那里光被高倍放大并转换成为电流。这个电信号经过前置放大、视频放大后，用它去调制显像管的亮度。由于控制镜筒入射电子束的扫描线圈的电路同时也控制显像管的电子束在屏上扫描，因此两者是严格同步的，在样品上被扫描的区域与显像管的屏是点点对应的。在样品上任何一点上的二次电子发射的强度的任何变化将表现为在屏上对应点的亮度的变化，用这种方法就如电视机屏上的像一样，一点一点，一线一线地组成了像。这个像可以在观察显像管的屏上观察，也可以把照相显像管屏上的像拍摄记录下来。 由二次电子所形成的像二次电子像，反映了样品表面的形貌。我们可以这样理解：二次电子像每一点的相对亮度取决于样品对应点的二次电子发射率，每点的二次电子发射率取决于电子束的加速电压、束流、电子束的入射角(即入射束与样品表面法线间的夹角)和样品原子序数。对于加速电压和束流给定的电子束，二次电子发射率主要取决于电子束的入射角； 次电子发射率 可见，二次电子的产生额随入射角的变化而变化，这个问题可以图24作定性的说明。二次电子的发射是由于入射电子碰撞样品的核外电子，核外电子获得能量脱离原子而成为二次电子。因此二次电子只产生于入射电子的散射区域，这个散射区域呈“泪滴”状的。二次电子的能量很低(50eV)，所以能逸出固体表面而进入空间的电子，只限于发生在非常靠近样品表面(大约100 )的二次电子。在图24(a)的情况，电子束垂直入射， =0,散射区与样品表面非常接近的区域面积很少，故二次电子发射很少。在(b)和(c)的情况， 0，散射区与样品表面接近的区域面积较大，故二次电子发射就多。当 90，二次电子发射最多。所以二次电子的产生额随入射角而变化。当样品表面是凹凸不平时，入射角不断改变，二次电子的产生额也随之而变化，二次电子像的亮度也随着样品的表面形貌而变化，所以二次电子像能反映样品表面的形貌。实际的像与日常照片中的负片相似。图25是在扫描电镜中样品表面形貌(剖面)和二次电子产生额的对应关系，说明二次电子像确实是反映样品表面的形貌。 此外关于放大倍数，分辨率以及焦深等作简单介绍如下： 放大倍率：扫描电镜像的放大倍率(M)由屏的大小(某边长乚)与电子束在样品上扫描区域的大小(对应边长l)的比例决定：M=l/L。通常显像管屏的大小是固定的，而电子束扫描区域大小很容易通过改变偏转线圈的交变电流的大小来控制。因此扫描电镜的放大倍数很容易从几倍一直达到几十万倍，而且可以连续地迅速地改变，这相当于从放大镜到透射电镜的放大范围。这是扫描电镜的一大优点。 分辨本领：扫描电镜像的分辨本领取决于一些因素，其中最主要的是电子束斑的直径。但电子枪亮度，样品的性质，相互作用的方式以及扫描速度和像的线数也是有关的。二次电子由于作用区最小因而像的分辨率最高，接近电子束斑直径。其他如背散射电子、X射线以及阴极荧光等作用区较大因而像的分辨率较低。目前商品扫描电镜的二次电子像的分辨率一般达到20-30 ，使用场发射电子枪可达约5 。 焦点深度(即焦深)：焦深是指保持像清晰(即保持一定的分辨率)的条件下，物面允许的移动范围。大的焦深不仅使聚焦变得容易，而且对于凹凸不平的样品仍然获得清晰的像，从而增强了像的立体感，使图象易于分析。扫描电镜的焦深很大，这是由于电子束孔径角很小的原因。从而造成扫描电镜像的立体感非常强，这也是扫描电镜的另一大优点。 编辑扫描电子显微镜的功能和特点编辑功能由于扫描电镜是採用逐点扫描的方法获得放大的像，因此入射电子与样品的相互作所产生的全部信息，只要有合适的探测器，扫描电镜都能用它们来成像，因而功能很多。这是扫描电镜又一大优点。那么电子与样品相互作能产生那此信息，它们反映样品什幺性质呢？电子与样品的相互作用会产生多种的信息，基本上分成两大类：一是电子，有二次电子(Secondary electron)、背散射电子(或称反射电子，Back scattered electron)；俄歇电子(Auger electron)、透射电子(Transmission electron)、吸收电子(Absorbed electron)等。二是射钱，有X射线和阴极荧光(Cathodoluminescence)等。下面作简单的介绍： 二次电子：入射电子与样品的核外电子碰撞，使后者脱离原子变成二次电子。用二次电子所成的二次电子像反映了样品表面的形貌，它的分辨率最高，是扫描电镜主要的用途。 背散射电子：是入射电子被样品反射回来的一次电子，用背散电子获得的图像有两种情况：一种可以反映样品表面的形貌与二次电子像相似，优点是较稳定，不受充电效应和污染的影响，缺点是分辨率较低。另一种情况是反映样品的密度和原子序数。利用这种特性，可以将生物组织中各种细胞用重金属染色，再把它检测出来。这种组织化学和扫描电镜结合的方法已受到广泛的重视。 X射线：入射电子与样品核外电子碰撞使后者脱离原子变成二次电子，而原子在失掉一个电子后变成离子，此称电离。电离使原子处于较高能量激发态，这是不稳定的。外层电子会迅速填补内层电子空穴而使能量降低，称为复位。如一个原子在入射电子的作用下失掉一个K层电子，它就处于K激发态，能量是Ek。当一个L2层电子填补了这个空穴后，K电离就变成L2电离，能量由Ek变为EL2这就会有数值等于(Ek-EL2)的能量释放出来。能量释放可以采取两种方式：一种是产生X射线，即该元素的K辐射。X射线的波长是有特定数值，随元素不同而异。这种X射线一般称为特征X射线或标识X射线。如果我们测定出特征X射线的波长及强度就能对样品成分进行定性和定量的分析。用特征X射线对样品进行成分析的方法有二种： 波长分散X射线微区分析法(Wavelength dispersive Xray microanalysis，简称WDX) 能量分散X射线微区分析法(Energy dispersive Xray microanalysis，简称EDX) 前者优点是分辨率高，分析范围大，但灵敏度低，速度慢，容易造成样品的污染与损伤，适宜于定量分析。后者优点是灵敏度高，简单快速，对样品污染和损伤小，但分析范围窄，分辨率低，适宜于定性分析。无论是EDX或WDX都越来越广泛应用于生物学中。尤其EDX，与计算机结合对获得的数据进行处理,实用而有效。 Auger电子：另一种能量释放方式是继续发生电离。上述K层电子复位释放出的能量(EKEL2)，使另一核外电子脱离原子变成二次电子。如果ExEL2EL2，就可能使L2层电子逸出，产生相应的电子空穴，这种二次电子称为KL2L2电子。它的能量近似地等于EK-EL2-EL2,也有固定值，随元素不同而异。这种具有特征能量值的电子是俄歇(Auger)在1925年发现的，故称为俄歇电子。既然俄歇电子有特征能量，我们就可以利用它来进行样品元素分析，称为俄歇电子能谱分析(Auger Electron Spectroscopy简写为AES)。综上所述，K激发及复位释放出来的能量或者产生K幅射(X射线)或者给出K俄歇电子，这两个过程是对立的，有此无彼的。在轻元素俄歇电子放出率高而X射线低，在重元素则正好相反。故X射线适合于重元素的成份分，而俄歇电子适合于轻元素的成份分析。 阴极荧光：入射电子与样品相互作用而发射出可见光或红外光,紫外光的现象称为阴极荧光。阴极荧光具有一种电子束激发的光谱，和原子里面层状结构有关。因此，若将荧光光谱进行分光分析，可用来鉴别主体物质和分析杂质含量，是非常富有发展前景的分析手段，甚至有人期待于向免疫阴极荧光(immunocathodoluminescence)的方向发展。Pease和hayes使用阴极荧光来观察用硫黄素(Thioflavin，T)染色的菠莱叶，可以看到这种染料选择性地分布手细胞壁上。此外还有透射电子，由它成的像和透射电镜成像基本一致。上述可见，扫描电镜不单能观察样品表面形貌，而且还能对样品的微区成分进行定性和定量的分析等。这种能对样品进行多种性能的分析,是扫描电镜的一个大优点。 编辑特点综合上述，我们可以看出扫描电镜具有一些极有价值的特点。 1. 它能在很大的放大倍数范围工作，从几倍到几十万倍，相当于从放大镜到透射电镜的放大范围。以致使用者可以首先概观整个样品：如昆虫、植物种子等，然后迅速转换到观察某些选择的结构的细节，这给观察带来很大的方便。 2. 扫描电镜具有很大的焦深,其焦深300倍于光学显微镜。例如在放大倍数是500倍时，焦深可达1000m。因而对于复杂而粗糙的样品表面，仍然可得清晰聚焦的图像。并且图像立体感强，易于分析。 3. 由于样品与终像之间没有透镜，使扫描电镜的操作十分简单。 4. 样品制备较简单，甚至可以不作任何处理。并且样品可以很大，如直径可达10cm以上。 5. 在观察样品表面形貌的同时又可对样品进行微区成分的无损分析。 编辑扫描电子显微镜的实践扫描电镜的操作，因型号不同而有所差异，但一般要较透射电镜容易。随着仪器自动化程度的提高，操作越来越简便。但是要熟练地运用扫描电镜，并能获得高质量的照片，仍然需要掌握一定的要领。 编辑一般的操作扫描电镜的一股操作步骤如下： 1. 启动电镜。包括接通电源，开动真空系统进行排气，在真空度达到要求后，接通显示单元电源。 2. 放入样品，注意调节样品高度。 3. 设定观察条件。这些条件包括：加速电压、束电流、光栏直径、工作距离、放大倍率以及倾斜角等。注意选择好视野。 4. 聚焦，消散。 5. 照相摄影。根据底片特性选择合适的反差、亮度及拍摄时间。 6. 停机。关掉电源和冷却水。 正确操作的目的是为了获得高质量的照片。高质量的照片应满足以下要求： 分辨率高; 视野选择好; 图像景深大，立体感强; 图像层次丰富，即要求反差与亮度适当; 要获得高质量的照片就要求正确地操作和正确地选择观察条件。操作具体步骤，各型号仪器有所不同，仪器说明书有详尽介绍。这里简单介绍操作中几个带有普遍性的问题： 1. 合轴:与透射电镜一样，扫描电镜也应良好地合轴，合轴不良将引起像差使分辨率下降，而且会便讯号减弱，降低信噪比，使图像质量变差。物镜光栏不合轴，使像散无法消除，从而降低分辨率。在操作中如发现聚焦过程图像移动，有可能是物镜光栏不对中，此时像散无法彻底消除。 2. 聚焦和消散:消散和聚焦是需要熟练掌握的操作，稍有不慎图像质量明显下降，两者是交替同时进行的。方法如下：首先放大倍数放在10000倍以上，先粗聚焦，然后在像中选择一边缘清晰，反差较强的小颗粒，在焦点附近反复做稍欠焦正焦稍过焦操作。如果存在像散，就会出现在欠焦和过焦时像被拉长，而且欠焦与过焦时拉长方向是垂直的；在正焦时像不被拉长但不清晰。此时在正焦情况调节消散器的方位和大小，直至图像最清晰为止。然后重做欠焦正焦过焦操作，如果图像没有被拉长，说明像散已被消除。此时可进行精确聚焦，由于扫描电镜在改变放大倍率时焦点不变，因此，聚焦时通常把放大倍数放在拍摄时使用的倍数的23倍进行，这样更容易判断是否正焦；调节聚焦旋钮至图像最清晰就是正焦。值得注意的是：样品高度改变，焦点就会改变，就要重新进行聚焦。因此，移动样品后，样品高度可能有所变化，此时必须重新聚焦。 3. 反差和亮度的调整:如果图像的反差与亮度调整不当，会使图像层次少，细节会掉失。通常扫描电镜图像的反差调整是靠改变光电倍增管的电压(300600V)来进行的，而亮度是靠改变信号的直流成分来调节。但是一般来说，增加反差也增加了直流成份，因而亮度水平也会增高，所以调节反差要和调节亮度水平同时进行。过高过低的反差或亮度，图像细节会掉失。在拍摄时应根据底片的型号和特性来调整反差和亮度，而图像的反差大小与亮度水平由曲线的振幅和高低来确定。 编辑扫描电子显微镜图像的缺陷扫描电子显微镜图像由于种种原因会发生多种的缺陷，我们了解这些缺陷及产生原因，就可以在实验中尽可能避免或减少这些图像缺陷，从而获得高质量的图像。常常发生的图像缺陷有: 荷电效应： 当入射电子作用于样品时，从样品上会发出二次电子、背散射电子和俄歇电子(假定电子不能穿透样品而无透射电子)。但主要是二次电子，它的数量远大于后两者，二次电子的发射率会随入射电子的加速电压而变化。图26是表示二次电子发射率随入射电子的加速电压变化的曲线，图中横轴Vo表示入射电子的加速电压。纵轴表示二次电子发射数与入射电子数之比。 Image:Example.jpg 从图中可见，只有在Vo=Vol和V0=V02， 等于l，即入射电子数与二次发射电子数相等，此时样品既不增加电子也没有失掉电子，样品不带电。除此两点外， 1，样品会因吸收或失障电子而带电。一般电镜的加速电压VoV02(例如金的V01=150，V02=2000V)。如果样品不导电(生物样品一般不导电)，此时样品会因吸收电子而带负电。就会产生一个静电场干扰入射电子束和二次电子发射，并且当电荷积累到一定程度会发生放电，这些会对图像产生严重影响此称荷电效应，荷电效应对图像会产生一系列的影响： 异常反差。由于荷电效应，二次电子发射受到不规则影响，造成图像一部分异常亮，另一部分变暗(图27)。 图像畸变。由于静电场作用使电子束被不规则地偏转，结果造成图像的畸变或出现阶段差。 图像漂移。由于静电场作用使电子束不规则偏移引起图像的漂移。 亮点与亮线。带电样品常常发生不规则放电，结果图像中出现不规则的亮点和亮线。 出现像散。由于静电场作用使电子束难于聚集，或使得像散方向发生变化，以致无法消除。 减少荷电效应的方法有如下： 导电法。用金属镀膜、导电染色等方法使样品本身导电，使吸收电子通过样品台流向“地”，从而消除荷电效应。生物样品几乎都采用这方法，但不是能完全消除。 降低电压法。把加速电压降低，使Vo=V02, =1，入射电子数与二次电子发射数相等，就不产生电荷积累，消除荷电效应。通常使用加速电压为15kV。但因此会使分辨率下降。 快速观察法。以尽快的速度观察和拍摄，使荷电效应影响不大时结束。一旦出现较明显的荷电效应只能改变观察区域或更换样品。另外，应尽可能用低倍观察。因为倍数越大，扫描范围越小，电荷积累越迅速，影响越大。 边缘效应: 在电子与样品相互作用的介绍中指出，二次电子的发射数量取决于“泪滴”形的电子散射区域与样品表面接近的面积大小。这样在样品表面凹凸变化大的边缘区域，散射区域与样品表面接近的面积异常增大，结果使边缘区域二次电子发射异常地增加。在图像中这些区域特别亮，造成不自然的反差，这称为“边缘效应”如图28所示，凹凸的边缘特别亮。这虽然并非由于操作引起的图像缺陷，但可通过适当的操作尽量减少。主要减少方法是降低加速电压，它可以使边缘效应相对减轻。 污染: 污染主要是镜筒真空中油和脂的蒸气等碳氢化合物和残存的水蒸气，在电子束的作用下而分解，碳等物质聚积在电子照射的部位而引起的。结果造成： 由于污染物的覆盖，使样品表面精细结构被遮蔽，从而使分辨率下降。 由于污染覆盖物的二次电子发射率低，使二次电子发射数目下降，从而造成污染区变暗。 当然，污染物同样也会污染镜筒使像散增加，从而使扫描电镜分辨率下降。 觧决污染的方法有： 改善电镜真空，减少真空中的油、脂的蒸气和水蒸气。 快速观察，在污染还不严重时完成观察和记录。 如果被污染区域的图像质量显著下降，应更换观察区域或更换样品。 损伤：扫描电镜观察时，样品可能受到的损伤有：真空损伤；电子束损伤。生物样品从大气中放入真空中时，就会产生真空损伤，主要是由于样品干燥引起的。努力避免真空损伤是扫描电镜生物样品制备的一个重要课题，临界点干燥法是一种较好方法。电子束损伤是由于入射电子的能量引起的。由于电子束照射引起样品照射点局部加热造成样品部分龟裂，也会引起化学结合的破坏。电子束损伤对某些对电子照射敏感的材料是一个严重影响，但对多数生物样品影响不大严重。 减少电子损伤的办法有；降低加速电压，减小电子束流，尽可能用低倍观察和拍摄；加厚喷镀金属膜。 编辑观察条件的确定扫描电镜的观察条件，如加速电压，光栏直径，聚光镜电流以及工作距离等，对扫描电镜的图像有明显的影响。对不同样品和不同的要求有各种选择，而每种选择都有其利弊。因此我们在工作中应根据样品特点及工作要求，权衡得失，选择适当的观察条件。简述如下： 1. 加速电压效应：电子束入射样品的能量取决于加速电压。加速电压越高，电子深入样品的深度大，散射区域范围扩大。相反加速电压越低，扫描图像的信息越限于表面，图像就越能反映表面真实面貌。加速电压越低，荷电效应越小，使图像质量改善，灰度层次丰富而且电子束造成的损伤也减弱。但加速电压越低，样品表面对于污染变得更敏感。而且，加速电压越高，电子束越容易聚集变细，易得到高分辨率，受外界干扰也较少，故合适于高倍工作。 2. 物镜光栏的选择：物镜光栏直径越小则扫描电镜焦深越大，不单聚焦变得容易而且对于凹凸不平的复杂样品，在低倍时仍然可获得清晰聚焦的图像，图像立体感强，易于分析。其次使电子束最小束班直径也缩小，从而提高像的分辨率。但光栏孔缩小会使束流减少，从而使信号减弱，信噪比下降而使噪音增大。此外，光栏会因孔径小而易被污染从而产生像散，造成扫描电镜性能下降。因此，权衡得失，根据需要选择最佳物镜光栏孔的直径。 3. 工作距离的选择：从物镜对样品的距离称为工作距离(WD)，一般扫描电镜的工作距离是在540mm之间。在高分辨率工作时，希望提高分辨率，要求获得较小的束斑，就必须使用短焦距的强磁物镜。因为强磁透镜像差小，从而能获得较小的束斑。而强透镜的焦距小，就要求小的工作距离，如WD=5mm。在低倍观察时，样品凹凸不平，要求图像有较大的焦深，则要使用大的工作距离，如WD=40mm。 4. 聚光镜电流的选择: 在扫描电镜中聚光镜的作用是缩小束斑直径。聚光镜电流增大，透镜变强，聚光作用也大，束斑直径变小，则图像分辨率提高，但是，束流变弱，结果信号变弱，信噪比降低，噪音影响大，图像质量下降。因此，在要求高分辨率工作时；使用大的聚光镜电流。在低倍工作时用小聚光镜电流，以减少噪音影响。 结束语：扫描电镜的特点显著地不同于透射电镜。后者重点在于达到高分辨率，对于细胞的精细结构、生物大分子及其复合体、组装体的高分辨结构的研究，透射电镜是一个十分令人满意的仪器。然而，获得高分辨率的代价是复杂的仪器和复