DC培养方法.doc

树突状细胞（DC）培养方法准备：小鼠（8-10周龄）、玻璃皿（用于解剖小鼠）、培养皿（塑料，DC在光滑的皿里转化的好，因此最好使用一次性的塑料培养皿）、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管（50ml、100ml用饭盒多装一些）、锡箔纸、1ml注射器。细胞因子：GM-CSF、IL-4高压灭菌：除锡箔纸、注射器，其他物品都需要高压灭菌。实验步骤：1取下小鼠的四肢（后两肢最好），分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤（用纱布反复的搓），完全暴露出骨及其附带关节，注意不要离断关节。将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨。2用1ml注射器吸取GKN（1640也可以，但费用较高），冲洗骨髓至骨完全变白，吹入两个离心管，便于离心找平。31000转5分钟离心，倒掉上清液，再用1640悬起再离心一次，倒掉上清液。4加细胞培养液，将骨髓细胞重悬。一只小鼠大概分4个培养皿，重悬的细胞总量尽量保持4ml。5细胞至于培养皿，补充培养基。即1ml细胞+4ml培养液。6加入细胞因子，IL-4和GM-CSF以向DC转化。 GM-CSF 20 ng/ml 加入浓度 IL-4 10 ng/ml 用锡箔纸包裹，避光放入培养箱。轻拿轻放不可摇晃。7第三天（之前不可拿出）等量加入培养基即4ml，并加入对应量的细胞因子。8第67天骨髓细胞中可转化为DCS（镜下）（预计：50ml细胞培养液、100mlGKN，）GKN平衡盐缓冲液NaCL 8gKCL 0.4gNa2HPO412H2O 3.56g NaH2PO4 0.78g 1L 配好后进行过滤除菌。(NaH2PO42H2O 1.014g)葡萄糖 2.0g酚红 0.01g去离子水（高压灭菌）由于实验室中仅有NaH2PO42H2O因此换算如下：NaH2PO4 NaH2PO42H2O（Na：23；P：31）相对分子量 120 156质量 0.78 1.014因此加NaH2PO42H2O为1.014g.1640培养基NaHCO3 2g1640培养基粉 1袋 1L 用0.22m滤膜过滤去离子水（高压灭菌）细胞培养液普通1640培养液巯基乙醇（终浓度15mol/L）Hepes（终浓度：10mmol/L）双抗进口胎牛血清1巯基乙醇：母液为14.4mol/L，先用去离子水进行1000倍稀释，浓度变为14.4mmol/L（相当于14.4mol/ml），在每升的培养基中加入1ml即可（相当于再进行1000倍稀释），终浓度近似为15mol/L。2Hepes：所需量=终浓度*分子量=10mmol/L*238.31g/mol=2.3831g/L3牛血清：每升加100ml。4双抗：每升加1105个单位（两种一样）。巯基乙醇（稀释液） 1ml血清 100mlHepes 2.3831g 1L细胞培养液青霉素（40万单位/ml） 250l庆大(4万单位/ml） 2500l1640培养基 900ml 一只鼠4皿，4*9=36ml细胞因子1. IL-4：10g加入1ml培养基配成浓度为10g/ml的母液。即10ng/l。本实验每皿5+4l。将原瓶离心，使瓶中粉末全部沉入管底，在瓶中加入培养基100l，制成浓度为100ng/l的母液，并按10l/EP管的量进行分装（共分10管），取一管加入990l培养基，制成浓度为1ng/l的稀释液，并按200l/EP管的量进行分装（共分5管）。分装后-20冻存。本实验每皿加入50l，三日后补加40l。（即一只鼠分4皿，需360l的稀释液）1管母-供2只余280l的稀释液，10管母-20只余2800l的稀释液，即27只余280l的稀释液。2. GM-CSF：10g加入1ml培养基配成浓度为10g/ml的母液。（本实验加入GM-CSF浓度按10ng/ml计算，每板5ml体积，需母液5l。）将原瓶离心，使瓶中粉末全部沉入管底，在瓶中加入培养基100l，制成浓度为100ng/l的母液，并按20l/EP管的量进行分装（共分5管），取一管加入1980l培养基，制成浓度为1ng/l的稀释液，并按400l/EP管的量进行分装（共分5管）。分装后-20冻存。本