2010食品生物技术实验-基因工程

实验一、实验二 动物组织DNA的提取及核酸浓度的测定一实验目的1. 掌握DNA的提取原理和方法；2. 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。二实验原理1. CTAB法提取动物组织DNA：CTAB法原理：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。2. 紫外吸收法测定核酸的含量和纯度： 组成核酸分子的碱基，均有一定的吸收紫外线特征，最大吸收值在波长为250-270nm之间。例如，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶为267nm， 鸟嘌呤为276nm，胸腺嘧啶为264.5nm，尿嘧啶为259nm。这些碱基与戊糖，磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为确定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，1 OD的光密度相当于双链DNA浓度为50g/mL，单链DNA或RNA为40g/mL，单链寡聚核苷酸为20g/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。分光光波法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260A280)估计核酸的纯度。三实验仪器与试剂1. 实验仪器紫外/可见分光光度计、电子天平 、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡混匀器2. 实验试剂细胞裂解液（50mM Tris-HCl PH 7.5；1.5% CTAB；1M NaCl；15mM EDTA ）；沉淀液（1% CTAB；50mM TrisHCl PH 7.5；10mM EDTA）；20mg/ml蛋白酶K；氯仿；1.2M NaCl；RNase；3M NaAc；冰乙醇；超纯水；四实验步骤1动物组织DNA的提取及质量鉴定1.1 消化 称取100mg动物组织肌肉柱，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎；然后加入400ul裂解液（50mM TrisHCl PH 7.5；1.5% CTAB；1M NaCl；15mM EDTA ）和12ul 20mg/ml蛋白酶K，置于55中过夜。 1.2 提取 将过夜的肌肉柱加入600ul氯仿，混合3min，静置2min，12000g离心2min。取上清，加入500ul氯仿，颠倒混合1min， 12000g离心2min。(重复上述步骤直至上清无沉淀)取上清，加入500ul沉淀液（1% CTAB；50mM TrisHCl PH 7.5；10mM EDTA；）混匀，静置2min，65水浴10min。12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀。加入200ul 1.2M NaCl，轻轻混匀至DNA完全溶解，再加入6ul RNase ，置于37下15min。加入1ml 冰乙醇和100ul 3M NaAc，-20下5min，中间混匀一次， 15000g离心10min，所得沉淀即为DNA。弃除上清，再加入1ml 70冰乙醇清洗， 12000g离心5min 。将DNA沉淀于无菌空气中晾干，加入20ul无菌水溶解沉淀，置于4备用。2紫外吸收法测定核酸的纯度和得率 取6 L待测DNA样品，用蒸馏水稀释至3ml (500倍) 。用蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。加入待测DNA样品在三个波长处读取OD值。根据OD值计算DNA浓度或纯度。dSDNA=50（OD260-OD310）稀释倍数纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8，若OD260/OD280介于 1.7-1.9之间，说明DNA质量较好，1.8 为最佳；低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有 RNA 污染。五注意事项1. 动物组织尽量剪碎，以提高DNA的抽提效率；2 氯仿除蛋白过程，重复几次，直到氯仿和水的界面没有蛋白质的沉淀，上清澄清；3 用70%乙醇清洗DNA沉淀后，尽量把酒精除干净，必要可以用滤纸条小心吸干；六实验思考与总结1提取DNA的过程原理、所添加试剂的作用实验三、实验四 线粒体COI基因的PCR扩增及凝胶电泳一实验目的1. 了解 mtDNA的基本特性；2. 掌握PCR的原理与过程；3. 掌握DNA凝胶电泳的原理。二实验原理动物细胞的mtDNA 是共价闭合的双链DNA ，基因组小，分子量范围在15121918kb 之间，基因组中不含间隔区与内含子、无重复序列，无不等交换，无基因重组、倒位、易位等畸变。与核基因组不同的是线粒体基因组严格遵守母系遗传方式，因而1 个个体就可以反映出整个母系集团的情况。线粒体DNA 由于具有进化速度快、母系遗传和分子简单易于分析等特点而成为研究近缘种间和种内群体间遗传分化、动物群体遗传学和系统进化研究的重要对象。动物组织mtDNA的提取过程包括组织粉碎、细胞裂解、纯化DNA、沉淀DNA、去除RNA污染等过程。1985年，美国PE - Betus 公司的人类遗传研究室Mullis 等人首创了PCR 技术。这是一种在体外模拟自然DNA 复制过程的核酸扩增技术，即无细胞分子克隆技术。它以待扩增的两条DNA 链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸为引物介导，通过DNA 聚合酶酶促反应，快速体外扩增DNA 序列。一般包括DNA 变性、退火、延伸等若干次循环。PCR 扩增倍数理论上为2n (n为循环次数，多为2545 次)。PCR可用于极度微量、甚至单个DNA 模板的体外分子克隆，具有快速、特异、灵敏、简便的特点。琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide， EB)染色， 在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外， 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带， 用于以后的克隆操作。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质， 其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中， 在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移， 其迁移速率由下列多种因素决定: . DNA的分子大小 . 琼脂糖浓度 . DNA分子的构象 . 电源电压 . 嵌入染料的存在 . 离子强度影响三实验仪器与试剂1.实验仪器PCR仪、电泳仪、数码凝胶成像仪、台式高速离心机、微量移液枪、微波炉（或电炉）2. 实验试剂PCR试剂：25mM MgCl2 ，10mM dNTP ，两种引物(COIer，COIef)，Taq DNA聚合酶，10PCR Buffer（Mg-）；超纯水；电泳试剂： 50TAE缓冲溶液：取242g Tris溶于水，加入57.1ml冰乙酸和100ml0.5mol/L的 EDTA（pH 8.0），定容至1 000mL。作为电泳缓冲溶液时应稀释50倍。 6电泳加样缓冲液：0.25 溴粉蓝， 40(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4。 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/mL， 用铝箔或黑纸包裹容器， 储于室温即可。 DNA分子量标准（DL2000） 1%琼脂糖(Agarose)四. 实验步骤1PCR扩增采用PCR技术对线粒体COI基因序列片段进行了扩增，所用正链引物和反链引物序列分别为（均为5-3）：COIef ：5-ATAAT GATAGGAGGA/GTTTGG-3COIer ：5-GCTCGTGTA/GTCTACA/GTCCAT-3PCR反应总体积为50ul，包含25mM MgCl2 3ul ，10mM dNTP 1ul ，两种引物各1ul，Taq DNA聚合酶（上海生工）1ul，10PCR Buffer 5ul以及 模板DNA 1ul。在Authorized Thermal Cycler扩增仪（eppendorf公司）上经94 预变性5min后经过30个循环，每个循环包括：94 50sec，46 1 min，72 1 min，最后72延伸10 min。2. 凝胶电泳 . 取50TAE缓冲液10mL加水至500mL， 配制成1TAE稀释缓冲液， 待用。. 胶液的制备：称取0.5g琼脂糖， 置于200mL锥形瓶中， 加入50mL 1TAE稀释缓冲液， 放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化， 取出摇匀， 此为1琼脂糖凝胶液，加入终浓度为0.5g/mL EB。. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽置于水平支持物上， 插上样品梳子，梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液其终浓度为0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封有机玻璃胶槽两端内侧， 待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内， 使胶液形成均匀的胶层。倒胶时温度不可太低， 否则凝固不均匀， 速度也不可太快， 否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子， 注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。. 加样：取5L酶解液与1L 6加样缓冲液混匀， 用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低， 则可依上述比例增加上样量， 但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换枪头， 以防止互相污染， 注意上样时要小心操作， 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。. 电泳：加完样后， 接通电源。控制电压保持在60-80V， 电流在40mA以上。当溴酚蓝条带动到距凝胶前沿约2cm时， 停止电泳。观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。DNA分子量标准 目录号：MD1146 l加样，凝胶长度10 cm电压8 v/cm 1TAE Buffer1、 产品说明本产品为即用型产品，已含有1Loading Buffer，可根据实验需要，直接取3-6 l电泳，使用方便，电泳图像清晰。本产品中六条带分别为2000、1000、750、500、250、100 bp，若上样量为6 l，则 750 bp带约为100 ng，其余带约为50 ng。2、使用方法1)取3-6 l本产品加入琼脂糖凝胶的加样孔中（每1mm点样孔宽度加1 l，如果加样孔较宽，可适当增加上样量），进行电泳。注意：建议电泳条件为1.0-2.5%琼脂糖凝胶，电压4-10 v/cm。2)电泳完毕，通过EB染色，在紫外灯下观察电泳条带。五实验注意事项：1. PCR是微量反应，每种试剂的多少都可