E coli pUC19质粒的提取、纯化与检测.doc

实验一 E. coli pUC19质粒的提取、纯化与检测一、实验目的 1.掌握碱变性法提取法的原理及各种试剂的作用。2.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。3.学习凝胶的制备及电泳方法。4.学习并掌握凝胶电泳分离纯化DNA的实验。二、实验原理1. 细菌质粒DNA细菌细胞内的DNA按照分布主要有染色体DNA( Chromosome DNA)与质粒DNA(Plasmid DNA)两类，其中质粒是一种环状的双链DNA分子，是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。质粒在细胞内以共价环状DNA（cccDNA）的形式存在，呈超螺旋状态。在质粒提取过程中，由于机械外力的作用，质粒的天然超螺旋结构遭到破坏，如果一条链完整，另一条链存在缺口时，称为开环DNA (oc DNA；若双链DNA均发生断裂，则呈线状DNA (L DNA)不同的质粒DNA尽管分子量相同，但是分子的大小不同，电迁移速率不同，因此可以通过多种方法将同构型的质粒DNA区分开。本次实验要提取的质粒是具有Ampr标记的pUC19质粒该菌株的碱基大小约为2.69kbp。2. 碱变性法提取质粒DNA 碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.0的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。而质粒DNA（cccDNA）的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH=4.6的NaAc（或者KAc）高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，重新溶解在溶液中；而染色体DNA不能复性，而与其他大分子形成缠连的网状结构，形成白色絮状沉淀。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。再用无水乙醇和盐溶液将溶于上清液中的质粒DNA沉淀，再用RNase除去RNA，粗提物中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后可获得较纯净的质粒DNA。3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.16.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，不同大小的分子的通过速率不同；此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动，电荷的多少与泳动速率亦存在着相关关系。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，不同的DNA分子就能够以不同的速率通过介质运动而相互分离。另外琼脂糖凝胶电泳配套使用的荧光插入性染料溴化乙锭（EB）能插入双链DNA。利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置，并能够在有参照的情况下半定量地对某条带的DNA片段的含量进行估计。三、实验材料试剂1实验材料E. coli DH-5受体菌（含有Ampr标记的pUC19质粒）。DNA marker Hind （TaKaRa公司产品）pUC19质粒 （TaKaRa公司产品）2培养基和试剂LB培养基：（液体）胰蛋白胨 10g,，酵母粉5g，NaCl 10g；加蒸馏水溶解，用NaOH调PH 至7.27.4，加水至1000 ml，121 高压灭菌15min；（固体）其他成分同液体，配好后加入1.5%的琼脂粉，121 高压灭菌15min。抗生素：氨苄青霉素（ampicillin），配制成100mg/ml母液备用。 溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)，10 mmol/L EDTA (pH=8.0),。高压灭菌15分钟，储存于4冰箱。溶液：200 mmol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH母液加无菌水稀释），1 SDS（从20% SDS母液中稀释），现配现用。 溶液：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸11.5mL，重蒸水28.5mL，高压灭菌，4冰箱保存。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。TE缓冲液：10 mmo/L Tris-Cl (pH=8.0)，1 mmol/L EDTA (pH=8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。RNase A母液：将RNase A溶于含10mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)和15mmol/L NaCl的溶液中，配成10mg/mL溶液，100加热15min 冷却后分装至1.5mL无菌离心管，-20保存。3 mol/L NaAc 。饱和酚。氯仿/异戊醇混合液：氯仿：异戊醇（体积比）24：1的比例在氯仿中加入异戊醇。预冷的无水乙醇、70%乙醇。6上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油），冻存。10TAE电泳缓冲液（40mmol/L Tris ,20 mmol/L NaAc,1mmol/L EDTA PH=8.0）。琼脂糖(Agarose)。1TAE缓冲溶液，用量筒量取40mL 50TAE缓冲溶液 定容至2L，得到1TAE缓冲溶液，供全班使用。溴化乙锭水溶液（10mg/ml ）避光保存。3器材用具 接种针、10ml移液管、洗耳球、三角瓶（300ml）、量筒、冰块、牛皮纸、线绳、纱布、棉花、塑料手套、乳胶手套、酒精灯。电子天平，恒温振荡培养箱、高速冷冻离心机、台式离心机、漩涡振荡器、微波炉、电泳仪、紫外灯（紫外观察仪）。Eppendorf离心管（50mL、1.5mL）、微量移液器（1000L量程、50L量程、10L量程）、移液器枪头（蓝、黄）、制胶槽、电泳仪、18孔梳子。四、实验步骤1实验准备按照实验材料试剂列出的清单和配制方法，进行试剂的配制（配制完成后灭菌或冷冻保存）和实验仪器的准备。2细胞培养在含有Ampr的LB平板上接种含pUC19质粒的E. coli DH-5菌株，37下培养过夜。Ampr上寻找生长良好的菌落，转接到50mL 含Ampr的LB液体培养基中，37，150rpm振荡培养过夜。取菌液以50%接种量接种于新的LB液体培养基中，37，150rpm振荡培养46h至菌体生长至对数期备用。3质粒DNA提取取50mL离心管，称得其重量W1=14.265g；将细菌培养得到的菌液加入离心管，至液面距管口1.52.0cm；6000rpm，4，离心5min，弃上清液。用移液器移取5mL溶液I，在漩涡振荡器上振荡悬菌；6000rpm，4，离心5min，弃上清液，将管倒置于纸巾，使液体流尽，称得其重量W2=14.418g；得到湿菌体的质量（W2-W1）=153 mg。 按每100mg菌体加入1.0ml的比例加入溶液I，加入量四舍五后为2.0mL，混匀后冰浴5min；再加入4.0mL的溶液颠倒混匀，冰浴5min；加入3.0mL的溶液，颠倒混匀，冰浴10min；12000rpm，4，15min。转移上清液至新50mL管，记下转移体积V1=400L；加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20保存3060min；12000rpm，4，15min，弃上清。加入5mL 70%的乙醇溶液，倾斜并转动离心管使之与管壁充分接触；12000rpm，4，15min，弃上清；再次用70%的乙醇溶液清洗，将管倒置于纸巾，使液体流尽；37 干燥1015min。加入1mL TE液体溶解沉淀；转至1.5mL离心管。向粗提取中所得的1mL溶液中加入10mg/mL 的RNase A母液 15L使得RNase A浓度为150g/mL；37 60min120min。4质粒DNA纯化将得到的DNA溶液平均分装于2个1.5mL的离心管中，每管500L，分别加入等体积的饱和酚溶液，涡旋振荡混匀；离心12000rpm，5min。转移上层水相至新离心管中，记下转移体积V2（400L，400L）；分别加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），用涡旋振荡器悬菌；离心12000rpm，5min。转移上层水相至新离心管中，记下转移体积V3（350L，350L）；加入氯仿/异戊醇混合液（24：1），混匀；离心12000rpm，5min。转上清至新离心管记下转移体积V4(320L，310L)；加入1/10体积的3 mol/L NaAc和2倍体积的预冷的无水乙醇混匀，-20冰箱中保存60min；12000rpm，15min，弃上清。加入500L的70%乙醇溶液；12000rpm，4，5min，弃上清；再次用70%的乙醇溶液清洗，37 恒温培养箱干燥10min。每管加入25L TE溶解，可用指肚轻而快的弹动离心管加速溶解，备用。5DNA纯度检测琼脂糖凝胶电泳用量筒量取40mL 1TAE于300mL的三角瓶中，再加入0.4g琼脂糖，微波炉中加热沸腾23次，至溶液澄清。插入18个孔梳子（梳齿的位置应当在托盘地面上0.51.0mm），待凝胶温度冷却至5060后，缓缓倒入制胶槽（如果表面有气泡，就用移液器吸头将气泡移动到制胶槽边缘），等到凝胶完全凝固后变成乳白色不透明状，将梳子拔出。用拇指与食指轻轻移动胶板两侧，将凝胶体连同制胶槽放入加有1TAE缓冲液的电泳槽中，TAE缓冲液应当刚好没过凝胶约1mm。移液器移取3L样品与1L上样缓冲液混合，低速离心；离心完毕后，移取3L混合液，右手持移液器，左手扶住移液器，移液器吸头深入液面下，在加样孔的上方，将液体缓慢压出，由于密度大，样品混合液缓慢沉入加样孔中。（注：不同的泳道除了在加提取的样品外，还加入了未经RNase A处理的对照组样品、DNA marker /Hind （TaKaRa公司产品）、pUC19质粒 （TaKaRa公司产品）以及DNA marker / Hind +EcoR I处理过的pUC19质粒等作为参照。）点样完毕后，盖好电泳槽的盖子，选择电泳电压（不大于5V/cm，本次选择100V）及电泳方向，打开电源开关开始电泳，DNA样品从负极向正极移动。当前沿指示剂接近胶的前端1/3处时(实际电泳时间1h左右)，停止电泳，打开槽盖。戴上乳胶手套将凝胶取出，并用塑料板轻轻放入已经配好的EB染液中，避光染色10min，用塑料板转移至双蒸馏水中浸洗10min；浸洗完毕后取出凝胶，将凝胶放入紫外灯下观察并拍照。五、结果与讨论1.实验结果经过提取和纯化的样品的电泳结果如下图：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1823.1kbp9.41kbp6.56kbp4.36kbp2.32kbp2.03kbp思考题图1 碱变性法提取及纯化质粒pUC19电泳结果图注：Lane 1：DNA marker / Hind （10L TaKaRa公司产品，开链）；Lane 2：pUC19质粒 （100ng TaKaRa公司产品）Lane 3：/ Hind + EcoR I处理过的pUC19质粒；Lane 4、15： DNA (开链)；Lane 514 ：711组的样品，每组两管样品,上样3L/管（Lane 6 未经RNase A处理的对照组样品、Lane 13、14 为本组所提取样品）2.实验分析笔者所在第11组的样品所在Lane13 和Lane 14，以Lane 14为例进行提取样品的分析。 （1） 所指的位置离点样孔最近，如果有白色说明含有杂蛋白；Lane 14在此次几乎没有白色条带，说明含杂蛋白很少。Lane 4和Lane15 对应区段有白色条带，说明商品 DNA含有杂蛋白，纯度不高。（2） 所指的位置，根据Lane15 所指位置可知，属于 染色体DNA 区带，在此区域内亮度大（含量高），而且由于不同染色体分子量有差异，DNA的提取过程中染色体DNA部分片段化使得该区带宽度较长。比较可知，Lane 14此处亮度很低，说明样品中含有的染色体DNA也较少。（3）Lane 3 的样品是/ Hind + EcoR I处理过的pUC19质粒，由于Hind 和EcoR I有特异性的切割，因此pUC19质粒成为线性，显示出一条带（根据实验书附录八，常见限制性内切酶的识别位点，估计是切割出粘性末端），所指示的位置为非正常的线性DNA 正常的线性质粒DNA，而Lane 14 中所示的DNA 是由于提取过程中被酶类切割后变成线性的DNA，由亮度可知含量亦较低。（4）所指的位置，与Lane 2的pUC19质粒 （100ng, TaKaRa公司产品）所示的位置比较可得，此处主要为超螺旋状态的pUC19 质粒，而且根据宽度和亮度的关系（宽度之比经过测量大致是1:2，亮度大于条带）可推测出样品中大约含有300ng的pUC19 质粒。另外在书上差得得pUC19质粒的大小为2.69kbp，而已经超过了Lane1的marker的2.03kbp条带，这种现象的原因是因为，的质粒处于超螺旋状态，分子构象比较紧密而Lane 1 是L DNA，两者的泳动速率没有直接的可比性。（5） Lane 6组没有加RNase A 其条带属于RNA的条带，比较Lane6和Lane14可知，经过RNase A处理过的组基本上没有出现RNA的条带，说明RNase A 对RNA 的分解进行的比较彻底。六、实验小结总的看，本次试验电泳拖尾现象控制的较好，条带清晰；杂蛋白、染色体DNA的含量很低，说明提取样品的纯度较高；比较几条泳道的结果，Lane 14 样品在杂蛋白和染色体DNA的含量上明显少于其他条带，但是在条带与其他样品对应的条带亮度上差别不大，可能与过程中振荡的激烈程度，保温时间有一定关系，使得一部分超螺旋质粒DNA变成了线性或者开环DNA。以后应当注意这些条件的控制，在不降低纯度的情况下提高产率。另外此次实验电泳时间接近一个小时，导致了Lane 1的/ Hind DNA marker有两条带跑出了凝胶，在结果里只有六条带，而且部分的RNA也跑出了凝胶，虽然不影响此次观察和分析，但是为以后的实验提了醒，注意控制电泳时间。七、思考题1、碱变性法提取质粒DNA时，获得高质量的质粒DNA 的关键步骤有哪些？答：欲获得高质量的质粒DNA，必须彻底除去杂蛋白、染色体DNA和RNA。除去染色体DNA的关键步骤是加入溶液II和溶液III时，控制变性与复性操作时机：既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂成小片段，从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力要适当。一般加入溶液I时可用力振荡几次，使得菌体形成均匀的菌悬液，此时染色体DNA尚未释放出来，不必担心其分子断裂。加入溶液II以后，溶液变得粘稠、透明；加溶液III时，立即会产生白色沉淀。后两次加溶液，必须注意不能过分用力振荡，但又必须保证溶液混合充分，可上下颠倒离心管数次，直至混匀。除去杂蛋白的关键步骤就是在质粒纯化过程中，酚/氯仿/异戊醇混合液还有氯仿/异戊醇混合液的抽提后，取上清液时移液器应当缓缓吸入上清液，而且枪头不要接触到两相之间的杂蛋白层。除去RNA 的关键步骤在于RNase A处理样品时应该保证温度和反应时间，使得RNA被充分水解。2、碱变性法提取野生菌株的质粒DNA时，如果在琼脂糖凝胶电泳板上出现了5条带，则说明该菌株含有5个质粒。该结论对吗？怎样验证？答：这种结论是没有依据的，因为不同的条带可能是同一质粒的不同构象，每次实验都可能有各种因素造成DNA的解链，如本次实验中，超螺旋质粒DNA后面还有开链DNA的条带。验证方法：将每个条带的DNA进行回收，测定其碱基大小，如果相同说明很可能是同一质粒的不同构象；为了进一步验证可以进行DNA测序。另外，检测出有5个条带并不代表该菌株所有的个体都含有这5种质粒，同一菌株中可能存在含有不同种类质粒的菌，质粒的拷贝数也不尽相同，如存在F因子的菌株，所以这种“菌株含有5个质粒”的说法是不确切的。3、在提取的质粒DNA 中，含有大量的没有去除干净的RNA，其可能原因是什么？怎样解决？在质粒的提取纯化过程中忘记加RNase A、温度或者PH条件使得RNase A活力不高，或者反应时间太短RNase A的反应进行的不充分都可能导致提取的质量DNA中含有大量RNA。 解决方法（包括要注意的问题）如下：在抽提蛋白前加入足量的RNase A，在适宜的温度（37）下反应足够长的时间（12h），RNase A保存于冰箱中，现用现取；加入RNase A混合时不要猛烈振荡；算好加入RNase A的浓度，保证加入后浓度不低于150g/mL（本次实验采用150g/mL效果较好）。4、DNA 在琼脂糖凝胶中的电迁移速率的影响因素有哪些？答：DNA在琼脂糖凝