BMP-2文章--插图版final.doc

BMP-2对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响孙健 余优成 顾章愉 顾亮 毕玮【摘要】 目的通过携带骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2; BMP-2）基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchym alstem cells, BMSCs)后，观察BMP-2对BMSCs成骨作用的影响。方法原代培养大鼠BMSCs并进行传代及鉴定，用携带BMP-2的慢病毒感染第三代BMSCs后，进行骨向诱导，通过茜素红染色观察钙沉积；并观察细胞粘附能力及对成骨标志分子OPN、OCN、Col-及smad表达的影响。 结果原代培养出大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定；携带BMP-2和EGFP的慢病毒感染第三代BMSCs后，免疫荧光检测和RT-PCR及WB检测感染成功；大鼠骨髓间充质干细胞感染慢病毒后进行骨向诱导，钙沉积明显增加；BMSCs细胞粘附能力增强；OPN、OCN、Col-及smad表达增加。结论BMP-2通路增强细胞粘附及相关成骨分化因子的表达，可明显促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化，为BMSCs作为组织工程研究的种子细胞提供实验支持。【关键词】人骨形态发生蛋白2；大鼠骨髓间充质干细胞；成骨诱导 The study of BMP-2 in the osteogenic effect of rat mesenchymal stem cell SUN Jian,YU You-cheng,GU Zhang-yu,GU Liang,BI Wei Department of Stomatology,Zhongshan Hospital, Fudan University , Shanghai 200032 ChinaCorresponding author:YU You-cheng,Email:【Abstract】ObjectiveTo observe the role of BMP-2 in the osteogenic effect of rat mesenchymal stem cell isolate (BMSCs). Methods The primary culture of rat BMSCs was succeeded and then was identified. The rat BMSCs were infected with the recombinant lentivirus with BMP-2(Lenti-BMP-2). The osteogenic effect with BMP-2 was observed. In addition, adhesive ability of BMP-2-BMSCs was detected through adhesion assay and expression of osteogenic factors OPN、OCN、Col- and smad was observed by RT-PCR and western blot. Results Rat BMSCs were cultured and identified successfully. The osteogenic effect of BMSCs was improved by BMP-2. Lenti-BMP-2 BMSCs adhesive potential enhanced and osteogenic factors were up-regulated.Conclusions BMP-2 may facilitate the osteogenic effect of the rat BMSCs and would provide favourable cell resource for tissue engineering.【Key words】bone morphogenetic protein 2; mesenchymal stem cell; osteogenic effect近年来，随着骨组织工程研究的不断深入,骨髓间充质干细胞(bone mesenchym alstem cells, BMSCs)日益受到关注。 因其具有多向分化潜能而逐渐成为骨组织工程中首选的种子细胞1。本实验拟将骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein）BMP -2通过慢病毒载体感染入BMSCs，观察BMP-2对骨髓间充质干细胞骨向分化能力的影响。材料和方法1. 材料：（1）动物：取8周龄Sprague-Dawley 大鼠1只，体重180克， 雌雄不限（复旦大学上海医学院实验动物中心提供）。（2）病毒载体构建：携带BMP-2 和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的慢病毒表达载体，由上海吉凯公司协助构建， 通过扩增HT1080 细胞进行扩增。（3）试剂：L-DMEM、DMEM /F12、胎牛血清( Fetal Bovine Serum, FBS)为美国GIBCO 公司产品；胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、茜素红为美国Sigma公司产品；BMP-2小鼠抗大鼠单克隆抗体为美国密理博公司产品；兔抗鼠CD29、CD34多克隆抗体为美国Abcam公司；相应二抗为美国Jackson公司产品；CCK-8检测试剂为日本同仁化学研究所产品；免疫组织化学检测试剂盒美国Vector公司产品；成骨诱导分化培养液为上海生物工程公司产品。（4）主要仪器与设备：超净工作台（SW-CJ-1F型单人双面净化工作台，苏州市净化设备有限公司）；CO2培养箱(NAPCO Model5410)；倒置相差显微镜(BX-40，Olympus公司产品)；全自动酶标仪（美国BIO-RAD 公司产品）；MILLIPORE纯水仪(QGARDOOR1型,苏州净化公司)；低速水平离心机(DL-5型，上海安亭科学仪器厂)；高速水平离心机(CK2150型,美国Sigma公司)；分光光度仪（Color-Eye 7100A，美国沃特瑞尔公司）；流式细胞仪（美国BIO-RAD 公司产品）；高压蒸汽灭菌器（LS-B50L立式，上海华线医用核子仪器有限公司）。2. 方法：（1）SD大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养、纯化及鉴定：无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM浸泡清洗。眼科剪切除两端骨骺，显露骨髓腔，用10mL注射器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集冲洗液，应用密度梯度离心和贴壁法进行分离：收集骨髓悬液于15mL离心管中，1000 r/min室温离心3-5 min；离心后去上清，用5mL新鲜且含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至25 ml培养瓶中，置于37、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。约48 h后首次换液，以后3换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。当细胞融合达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，以5000个/cm2接种于新的25ml培养瓶，置于培养箱中继续培养。以后每2-3天换液1次，此时细胞记为P1(第1代)，以后待细胞80%-90%融合后重复上述步骤进行传代。通过流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物CD29进行鉴定：待P3细胞融合至90%左右，吸去培养基，用PBS充分洗涤细胞2次，加入2.5 g/L胰蛋白酶室温消化1 min，加入新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基终止消化，吸管仔细吹打，1000r/min室温离心7 min，弃上清，加PBS并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，并调整每个检测样本的细胞数为1106，分装至EP管中，1000 r/min室温离心7min，弃上清，于待检测的样本中各加入90LPBS，轻轻吹打成细胞悬液，加入CD90一抗及其同型对照各10L，充分吹打混匀，37 避光孵育30 min后，测试前再加400L PBS至总体积500 L，充分混匀，上机检测。（2）CCK-8检测细胞生长曲线： 取P1 BMSCs细胞以每孔1104/ml 接种于96 孔板中，每孔加培养液200l并设6个复孔。空白对照孔每孔加入200l 培养基，置于37 、5%CO2饱和湿度下孵育24 h，每24h取出一排孔板，将孔中的培养液吸去，用D-Hanks液洗涤2-3次，然后向每孔中加入100ul的细胞培养液以及10ulCCK-8溶液，在相同条件下继续培养2h，取出96孔板，在分光光度仪测定450nm波长处的吸光度值，取吸光度（OD值）为均值。在坐标纸上，以吸光度值作Y值，时间作X轴绘制出细胞的生长曲线。（3）实验分组：Lenti-BMP-2感染组（BMP-2组）、空慢病毒载体感染组（MOCK组）和未感染组（Control组）。取第三代细胞，以感染倍数（MOI=25）行病毒感染，8小时后换液置于37 、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养，荧光显微镜下观察感染效率及细胞生长情况。（4）BMP-2 基因感染后的表达检测：逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测BMP-2 mRNA 表达。根据genebank中基因的核酸序列进行引物设计（BMP-2引物序列： 5- TTGGAGGAGAAACAAGGTG -3（上游），5- AACAATGGCA TGATTAGTGG -3（下游）；Col-I引物序列：5-CAGACGGGAGTTTCTCCTCGG ACGT-3（上游），Reverse primer: 5- GACCAGGAGGACCAGGAAGTCCAC GT-3（下游）；OPN引物序列： 5- TGGTTTGCCTTTGCCTGTTCG-3（上游），5- ATGGCTTTCATTGGAGTTGCTTG -3（下游）；OCN引物序列：5- GGCGTCCTGGAAGCCAATGTG-3（上游），5-GACCAGGAGGACCAGGAAG TCCACGT-3（下游）；-actin引物序列：5-AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA-3 （上游），5-ATGCTGCTTACATGTCTCGAT-3 （下游）。扩增程序：95 5 min 变性，95 30s，55 30 s，72 1min，30个循环，72 延伸8 min。取RT-PCR 产物5 l 以1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。采用ScnImage 软件测定条带的净灰度值（net index，NI），并与内参照-actin灰度值进行比较。（5）Western-blot：PBS 漂洗各组BMSCs，加入冰预冷的裂解液后，收集细胞裂解物于EP 管中（每组8 例样本）。超声波粉碎细胞，4 条件下，12 000 r/min 离心10 min；收集上清液， 取5 l 测定蛋白浓度。以每泳道15 l（3g/l）加入十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行电泳； 电泳完毕后转移至醋酸纤维素薄膜； 室温下脱脂奶粉封闭3 h 后加入 BMP-2(1:200),OPN(1:1000),OCN(1:1000),Col-I(1:1000),smad(1;1000)一抗，4 过夜，PBS 洗膜3 次； 室温下二抗孵育2 h，PBS 洗膜3次，之后进行显色。GAPDH 为内参，测定净灰度值（NI）。（6）成骨诱导：取BMP-2和绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞，常规消化传代，以1108 L-1密度接种于预先放置有盖玻片的6孔培养板中，制备细胞爬片。在细胞长至80%融合度时，将培养基更换为成骨诱导液(包括0.1 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、10 mmol/L -磷酸甘油钠)，37 、5%CO2饱和湿度条件下继续培养，每隔3天更换诱导液。诱导分化第21天，吸去成骨诱导液，用PBS液冲洗，体积分数为95%的乙醇固定10 min，茜素红染色，显微镜下观察。（7）粘附实验：细胞消化、计数，制成2105/ml的无血清的细胞悬液。FN包被的96孔板每孔接种100 l上述细胞悬液，然后置37、5%CO2孵箱中培养3 h。取出96孔板，弃去其中的细胞培养液，PBS轻柔漂洗2次，弃去未粘附的细胞。每孔加入50 l 4%多聚甲醛，室温固定10 min，PBS漂洗2次。每孔加入50 l 龙胆紫染色液，室温染色15 min。弃去96孔板中的染色液，PBS漂洗数次。显微镜观察，计数细胞。每孔加入100 l龙胆紫溶解液，37放置30 min，然后用微孔板分光光度计读取585 nm处的光密度值。3. 统计学方法：结果以xs 表示，所测数据使用SPSS11.0 统计软件，采用方差分析，以P0.05 为差异具有统计学意义。结 果1.大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察：刚接种时细胞呈圆形，多数悬浮于培养液中。48h后大部分细胞贴壁，换液后可见部分贴壁细胞形态不一，呈梭形的成纤维细胞样或多角形改变，核较大，位于细胞中央或边缘。3天开始出现散在的贴壁生长的成纤维样细胞。传代细胞24 h内完全贴壁。第三代细胞呈均匀一致的纺锤形。连续传代20代以上，细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力，至融合状态所需时间无明显变化（图1）。图1 原代培养的BMSCs。A：48h的BMSCs（100）；B：第三代BMSCs（100）； C：第二十代BMSCs（100）。2.流式细胞仪分析第三代骨髓间充质干细胞表面标记：骨髓间充质干细胞CD29呈阳性表达，其表达在85%以上，而CD34则呈阴性表达（图2）。图2 第三代BMSCs表面标记的流式细胞术检测。CD29为BMSCs的标志物，呈阳性表达，而CD34则呈阴性表达。3.大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线：标准孔的平均吸光度OD值为0.186，根据各孔的OD值绘制生长曲线（图3）。由图可见，一般细胞接种密度下的骨髓间充质干细胞，三代细胞生长周期基本一致，均为接种培养后第23天，但生长较缓慢，为生长迟滞期。3 天后细胞生长有快速增长过程，达到对数生长期，在78天时，细胞总数达到最高值，为生长平台期，其后生长速度逐渐减缓。图3 BMSCs的生长曲线。4.基因表达检测（1）荧光显微镜观察感染结果：72 h后观察感染的细胞，可见BMP-2和EGFP的持续表达，绿色荧光分布于整个细胞，呈胞浆分布，说明BMP-2能在骨髓间充质干细胞中表达（图4）。图4慢病毒感染BMSCs后免疫荧光检测BMP-2。A：BMSCs的相差图（400）；B：BMP-2阳性细胞荧光检测图（400）；C：A和B的整合图。（2）RT-PCR 结果：与感染空载体的BMSCs、未感染的BMSCs 相比， 感染后的BMSCs 表达BMP-2 mRNA 显著增强，证实BMP-2目的基因已成功感染至BMSCs（图5）。图5 慢病毒感染BMSCs后RT-PCR检测BMP-2 mRNA的表达。（3）Western blot 结果：基因感染组的BMP-2表达明显高于空载体组和未感染组（图6）。图6慢病毒感染BMSCs后RT-PCR检测BMP-2蛋白表达。5.成骨诱导分化鉴定：成骨诱导21 d后行茜素红染色，BMP-2感染组和未感染组都显示出游大量橘红色矿化结节形成，但感染组的矿化结节明显多于未感染组（图7）。图7 BMSCs的诱导成骨。A：单独BMSCs的诱导成骨（100）；B：BMP-2感染BMSCs后的诱导成骨（100）。6.BMP-2增强了BMSCs的粘附能力 收集Control组，MOCK组和BMP-2组细胞，计数后铺入96孔板中，分别在20分钟，40分钟和60分钟后，检测细胞粘附的差别。实验发现，与MOCK组细胞相比较，BMP-2组BMSCs细胞粘附能力明显增强，且随时间而增强（图8）。图8 BMP-2使BMSCs细胞粘附能力增强比较。7. BMP-2促进了BMSCs成骨标志分子OPN、OCN、Col-及smad的表达 与Control组与MOCK组相比，BMP-2组细胞中OPN、OCN及Col-mRNA(图9)与smad蛋白水平(图10)均明显增高。图9 BMP-2促进了BMSCs成骨标志分子OPN、OCN、Col-的表达。图10 BMP-2促进了BMSCs smad的表达。讨 论骨形成蛋白（BMP）是转化生长因子-超家族中的一员：它是一组多功能酸性多肽，主要由成骨细胞合成和分泌，有20多种亚型2。BMP-2 是由396个氨基酸组成的多肽生长因子，能诱导未分化的间充质细胞转化为软骨组织和骨组织，参与肾、眼、脑、肌腱和牙等多种组织器官的发生及损伤修复。由于骨髓间充质干细胞具有诸多优势，其作为种子细胞在基因治疗、细胞替代治疗及组织工程等方面有日益广泛的应用3-5。基因功能研究的重要手段是基因转染，目前基因转染有多种方法，本研究在慢病毒载体介导下将BMP-2基因转入BMSCs中。已有研究表明，使用慢病毒载体向脑内引入目标基因,其感染神经元的效率均明显高于腺病毒载体或逆转录病毒载体。更具有优势的是这种载体不仅存在转基因表达的长期性,而且无明显的免疫反应6。因此，相比较腺病毒等其他载体系统,慢病毒载体有更多的优势,有望成为基因治疗的理想载体。而且，本研究也提示了通过慢病毒载体系统，可将BMP-2感染入骨髓间充质干细胞内，能明显促进其成骨分化能力。在组织形成过程中,各种活性物质都发挥着重要的作用。研究表明，BMP是参与骨形成的重要活性物质7。还有研究显示，BMP诱导成骨作用可分为四个阶段：趋化期、分化期、骨质形成及重塑期。其中，BMP-2被认为是活性最强的诱导成骨因子之一3。在这个成骨作用过程中，骨髓间充质干细胞在局部BMP-2的刺激下发生化学趋向、聚集、分化形成软骨和骨8-10。本研究在慢病毒载体介导下将BMP-2基因转入BMSCs中，使该基因在mRNA及蛋白水平呈高效表达，而且发现与对照组相比，BMP-2组BMSCs的成骨标志分子ALP、OCN、smad及Col-表达明显增高。ALP及OCN被认为是BMSCs向成骨分化及处于功能状态的标志11-12；Col-则是由成熟成骨细胞分泌的13；而smad则被认为是成骨过程中的重要因素14。此外，BMP-2不仅增加了BMSCs的钙结节形成，而且增强了BMSCs的粘附能力。以上结果均表明BMP-2表达增加促进了BMSCs向成骨细胞表型分化，提示其主要生物学作用是刺激未分化的骨髓间充质干细胞粘附、增殖及骨向分化，从而诱导新骨的形成。与以往的研究相一致15-16，本研究也进一步证实了BMP-2可以明显促进骨髓间质干细胞的成骨作用。由此，为今后进一步进行该基因感染及回输体内迁移与横向分化奠定了实验基础,也可对临床的基因治疗提供实验支持。参考文献：1 Lee HS, Huang GT, Chiang H, et al. 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