透射电镜原理

考研经济学,经济学（Economics）是一门研究人类行为及如何将有限或者稀缺资源进行合理配置的社会科学。 微观经济学（Microeconomics）又称个体经济学，是相对于宏观经济学而言。微观经济学主要以单个经济单位(单个的生产者、单个的消费者、单个市场的经济活动)作为研究对象，分析单个生产者如何将有限的资源分配在各种商品的生产上，以取得最大的利润；单个消费者如何将有限的收入分配在各种商品的消费上，以获得最大的满足。同时，微观经济学还分析单个生产者的产量、成本、使用的生产要素数量和利润如何确定；生产要素供应者的收入如何决定；单个商品的效用、供给量、需求量和价格如何确定等等。,考研的代价 1、时间（3个月） 生活费800元32400元 2、精力紧张、刻苦！ 3、少挣的钱 （3个月）工资2500元37500元 4、资料、辅导班费用、报名费等 2000元 共计：11900元 读研的代价 1、学费、书费、住宿费24000+1000+1300元 2、生活费 800元12月3年28800元 3、少挣的钱 2500元12月3年90000元 4、付出的精力！ 共计：133000（157000）元 读研的收获 1、找工作的敲门砖学位、论文 2、社会关系和老师的关系、和同学的关系 3、研究能力日后做好工作的基础（奖学金） 4、做好人、做好事的人生观、价值观,神经生物学研究中心实验室校形态学科研实验中心,实验室介绍： 实验室学习介绍：,实验室组成：,实验室人员：实验拥有两个实验区，约3500平方米面积实验室及设备： 形态学实验室： 免疫组化实验室 切片室 显微成像摄影室 电镜及电镜制样室 分子生物学实验室： 核酸实验室 蛋白实验室 细胞培养室 行为学实验室 小动物手术室、观察室 洗涤消毒室 研究生学习室,为何要学习实验技术 如何学好实验技术,进实验室工作的注意事项： 做好人做有公德的人、做聪明的人； 做好事做好人好事、做好实验、 做好学问； 注意安全注意物理安全、化学安全 ！,医学电子显微镜技术,本课程所用教材：超星图书馆实用电子显微镜技术 作者：邵淑娟，杨佩，许广沅等 出版时间：2007.12实用电子显微镜技术 作者：付洪兰编著 出版时间：2004.7生物医学电子显微镜技术 作者：程时 彭学敏 出版时间：1997年07月第1版,本课程考核试题： 试用你所了解的电子显微镜技术为研究手段，撰写一份研究项目设计书，请详述取材方法及注意事项。,本课程要求： 实验课不允许缺席。,The Resolution Scale,Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) 发现微生物的第一个人。他利用自制的显微镜发现了微生物世界。 Robert Hooke (1635-1703) 提出了光的波动说 ，特别是致力于光学仪器的创制 。用自己制造的显微镜观察植物组织，于1665年发现了植物细胞（实际上看到的是细胞壁），并命名为“cell”，至今仍被使用。 Ernst Abe (1840-1905) 阐明几何光学的“正弦条件”，确定了可见光波段上显微镜分辨极限，为迄今光学设计的基本依据之一Ernst Ruska (1906-1988) 1931年发明了第一台电子显微镜。因此获1986年获诺奖。,电子显微镜有何用途：,用于临床病理诊断 用于科学研究,上世纪60年代、70年代是国际上诊断电镜发展的黄金时代,越来越多的疾病通过电镜检查而得到确诊,越来越多的病理学家认识到了电镜诊断的价值,电镜逐渐成为病理诊断的一个基本工具,欧美国家中几乎所有大的医疗中心及医院都将电子显微镜用于疾病的研究和诊断。,电子显微镜在肾活检诊断、疑难肿瘤的病理诊断、感染性疾病(病毒性,细菌性等)、代谢性疾病(贮积性疾病)、细胞外物质沉积性疾病(如淀粉样变性)、组织细胞增生症(郎格罕细胞增生性疾病)、纤毛运动不能综合征等特殊疾病的诊断中公认起着重要的作用。,CADSIL（cerebral artosomal dominant arteriopath with subcortical infarcts and leukoencephalopathy) 即是伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病，是一种遗传性小动脉疾病，位于19号染色体上的Notch3基因突变所致的遗传性脑小血管疾病，表现为皮质下缺血事件，并导致进行性痴呆伴假性球麻痹。 临床表现 ： 1. 多在3545岁发病，多无高血压史，常有家族史。 2. 患者反复出现皮质下梗死及腔隙性梗死的症状体征，可 伴有头 痛，痴呆，假性球麻痹，抑郁和尿便失禁。 3. CT或MRI显示皮质下或脑桥的梗死灶。 4. 脑或者皮肤活检可见特征性血管壁变厚，血管平滑肌中层细 胞嗜锇颗粒沉积(GOM)，检测基因突变可以确诊。,镜下见血管内皮细胞及周细胞和平滑肌细胞中部分线粒体肿胀，小动脉血管增厚。36537照片中见可疑GOM小体。结论：符合CADASIL皮肤改变。,病毒性疾病的诊断离不开电镜,电子显微术是确定各种病毒形态结构最有用的工具，可观察病毒，或感染细胞内病毒的大小、形态、排列及其复制组装、成熟的过程以及某些有包膜病毒的芽生成熟的部位和病毒包涵体的形态特征。,电镜对下列肿瘤的鉴别诊断可起到重要作用: 区别癌、黑色素瘤和肉瘤; 区别腺癌和间皮瘤; 在前纵膈肿瘤中可区别胸腺瘤、胸腺类癌、恶 性淋巴瘤和生殖细胞瘤; 在小圆细胞瘤中可区别神经母细胞瘤、胚胎性横纹 肌瘤、Ewing氏肉瘤、恶性淋巴瘤和小细胞癌; 在软组织梭形细胞瘤中可区别纤维肉瘤、恶性 纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤和恶性神经鞘瘤; 区别梭形细胞癌和癌肉瘤。,电镜诊断用得最多的是肾脏活检和肌肉活检。对肾脏病的诊断,通常将光镜、免疫荧光光镜和电镜观察三者结合。电镜观察对于肌病的诊断有很重要的作用。,依靠电镜诊断的肾小球疾病有： 薄基底膜肾病、纤维丝样肾小球肾炎、免疫管状肾小球病、致密物沉积病、肾淀粉样变及纤维性肾小球病、Fabry病（电镜下显示上述细胞包含无数圆或卵圆形层状小体（这些小体被称为“斑马小体”或“髓鞘脂影”） ）、Alport综合征（特征性的病理改变，GBM广泛增厚、或变薄以及致密层分裂为其典型病变）等需电镜观察 协助光镜和免疫荧光诊断的一些疾病有： 胶原肾小球病、轻链重链沉积病、脂蛋白肾病、急性感染后肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎等。此外，电镜观察对一 些疾病病理改变的分期有决定性价值： 膜性肾病、狼疮性肾炎等（尤其在多靶点治疗某些类型的狼疮性肾炎时，需电镜观察分辨其组织类型）。,在某些肾病的诊断中电镜起着决定作用:,遗传性肾炎。此病肾小球的组织学改变无特殊,唯电镜检查方能作出准确诊断，例如肾小球薄基底膜病。光镜检查无助于对此病的诊断,电镜检查是唯一能够明确此病的手段;Farbry氏病。此病的嗜锇颗粒和板层小体只有在电镜下才能观察到;肾淀粉样变及纤维性肾小球病。此类疾病在电镜下见到类淀粉纤维由无分枝的周期性细纤维组成(直径810nm,肾淀粉样变)或微管状纤维结构(直径约20nm,纤维性肾小球病),因而可作出肯定的诊断。,FEI -Tecnai G2 Spirit TWIN,H-600,透射电镜的工作原理,光镜显微镜与电子显微镜的比较,有效放大倍数,光学透镜的分辨本领主要取决于照明源的波长。半波长是光学显微镜分辨率的理论极限。可见光的最短波长是390nm，光学显微镜的最高分辨率是200nm。人眼的分辨本领是大约0.2mm，把200nm的光学显微镜的最高分辨率放大到0.2mm让人眼能分辨的放大倍数是1000倍。这个放大倍数称之为有效放大倍数。光学显微镜的分辨率在200nm时，其最大的有效放大倍数是1000倍。光学显微镜的放大倍数可以做的更高，但是，高出的部分对提高分辨率没有贡献，仅仅是让人眼观察更舒服而已。所以光学显微镜的放大倍数一般最高在1000-1500之间。,如何提高显微镜的分辨率,顺着电磁波谱朝短波长方向寻找，紫外光的波长在13-390nm之间，比可见光短多了。但是大多数物质都强烈地吸收紫外光，因此紫外光难以作为照明光源。X射线具有更短的波长。但是，迄今为止还没有找到能使X射线改变方向、发生折射和聚焦成象的物质，也就是说还没有X射线的透镜存在。因此X射线也不能作为显微镜的照明光源。除了电磁波谱外，在物质波中，电子波不仅具有短波长，而且存在使之发生折射聚焦的物质。所以电子波可以作为照明光源。1926年，德国物理学家Busch奠定了利用磁场作为电子透镜的理论础。1932年，Knoll及Ruska，第一次成功地得到了电子放大的像。同年， Ruska用静电透镜研制成功了电子显微镜，简称电镜。,电子束的主要特征,定义：电子具有波动性和粒子性，电子束是真空中相对集中的、高速 运动的电子流。性质： 电场或磁场中高速运动的电子会受力发生弯曲，而改变运动方 向，受力方向服从右手定则，当电磁场满足轴对称条件，电子 做螺旋状运动，最后被聚焦。 电子穿透力极弱，100kV以下的电子束，标本厚度不超过100nm。 电子束为不可见光，通过激发荧光来显像。 高能电子束具有放射性，可激发出x射线。,样品,入射电子,Auger电子,阴极发光,背散射电子,二次电子,X射线,透射电子,电磁透镜,电子波和光波不同，不能通过玻璃透镜会聚成像。但是轴对称的非均匀电场和磁场则可以让电子束折射，从而产生电子束的会聚与发散，达到成像的目的。用静电场构成的透镜称之“静电透镜”；把电磁线圈产生的磁场所构成的透镜称之“电磁透镜”。,电磁透镜,电子在磁场中运动，当电子运动方向与磁感应强度方向不平行时，将产生一个与运动方向垂直的力（洛仑兹力）使电子运动方向发生偏转。图5-3是一个电磁线圈。当电子沿线圈轴线运动时，电子运动方向与磁感应强度方向一致，电子不受力，以直线运动通过线圈；当电子运动偏离轴线时，电子受磁场力的作用，运动方向发生偏转，最后会聚在轴线上的一点。电子运动的轨迹是一个圆锥螺旋曲线。,电磁透镜,短线圈磁场中的电子运动显示了电磁透镜聚焦成像的基本原理。实际电磁透镜中为了增强磁感应强度，通常将线圈置于一个由软磁材料（纯铁或低碳钢）制成的具有内环形间隙的壳子里（如图）。,电磁透镜,此时线圈的磁力线都集中在壳内，磁感应强度得以加强。狭缝的间隙越小，磁场强度越强，对电子的折射能力越大。为了使线圈内的磁场强度进一步增强，可以在电磁线圈内加上一对磁性材料的锥形环（如图所示），这一装置称为极靴。增加极靴后的磁线圈内的磁场强度可以有效地集中在狭缝周围几毫米的范围内。,电磁透镜的组成 极靴 中空的锥形体，最重要的部件之一; 线圈 绕在极靴外，通电后可产生磁场; 屏蔽外壳 防止外部磁场干扰，增加导磁率， 产生强磁场，使焦距更小，放大更大;,电磁线圈与极靴,电磁透镜成像,光学透镜成像时，物距L1、像距L2和焦距f三者之间满足如下关系： （5-8）电磁透镜成像时也可以应用式（5-8）。所不同的是，光学透镜的焦距是固定不变的，而电磁透镜的焦距是可变的。电磁透镜焦距f常用的近似公式为： （5-9）式中是K常数，Ur是经相对论校正的电子加速电压，（IN）是电磁透镜的激磁安匝数。由式（5-9）可以发现，改变激磁电流可以方便地改变电磁透镜的焦距。而且电磁透镜的焦距总是正值，这意味着电磁透镜不存在凹透镜，只是凸透镜。,不同加速电压下的电子波波长,加速电压U/KV 电子波波长/nm 加速电压U/KV 电子波波长/nm,电磁透镜的像差及其对分辨率的影响,最佳的光学透镜分辨率是波长的一半。对于电磁透镜来说，目前分辨率还远远没有达到波长的一半。以FEI Tecnai G2 Twin 透射电镜为例，其加速电压达是120KV，若分辨率是波长的一半，那么它的分辨率应该是0.00334/2=0.00167nm；实际上这台透射电镜的点分辨率是0.35nm，线分辨率：0.20nm，与理论分辨率相差约209倍,什么原因导致这样的结果呢？电磁透镜也和光学透镜一样，除了衍射效应对分辨率的影响外，还有像差对分辨率的影响。由于像差的存在，使得电磁透镜的分辨率低于理论值。电磁透镜的像差包括球差、像散和色差。,一、球差,球差是因为电磁透镜近轴区域磁场和远轴区域磁场对电子束的折射能力不同而产生的。 原来的物点是一个几何点，由于球差的影响现在变成了半径为rS的漫散圆斑。rS表示球差大小，计算公式为：,1936年Scherzer 提出关于旋转对称电磁透镜的球差不可能靠其本身场分布的设计（它不能象光学透镜那样通过凸透镜、凹透镜的组合设计来补偿或矫正）而消除的理论以来, 电子透镜的球差一直是限制电子显微镜分辨率的根本因素。球差是像差影响电磁透镜分辨率的主要因素。,二、像散,像散是由透镜磁场的非旋转对称引起的像差。当极靴内孔不圆、上下极靴的轴线错位、制作极靴的磁性材料的材质不均以及极靴孔周围的局部污染等都会引起透镜的磁场产生椭圆度。 将RA折算到物平面上得到一个半径为rA的漫散圆斑，用rA表示像散的大小，其计算公式为：,像散是可以消除的像差，可以通过引入一个强度和方位可调的矫正磁场来进行补偿。产生这个矫正磁场的装置叫消像散器。,三、色差,色差是由于成像电子的能量不同或变化，从而在透镜磁场中运动轨迹不同以致不能聚焦在一点而形成的像差。,引起电子能量波动的原因有两个，一是电子加速电压不稳，致使入射电子能量不同；二是电子束照射试样时和试样相互作用，部分电子产生非弹性散射，致使能量变化。,反差与成象 电镜的反差主要是样品内各种物质对电子 束的散射，包括弹性散射和非弹性散射的不同 而引起的。光镜：反差是样品上不同区域的物质对光线具有不同的吸收率与反射率而形成的。,当一束电子入射到标本上，与标本中的原子相互作用产生四种基本物理过程：（1）吸收：在电镜成象中可以忽略；（2）干涉：引起相位效应，肉眼及底片对此不敏感；（3）衍射：在像上形成条纹（样品在弯曲的不同部位，晶面满足布拉 格衍射的条件不同而引起的）；（4）散射：是电镜中成象的最重要的因素。 弹性散射： 电子与原子核相撞，电子不损失能量，只改变运动方向； 非弹性散射： 电子与轨道电子相撞，能量分配，方向、速度均改变。,散射的意义： 散射电子能力强的地方，透过电子数目少，荧光屏上显示暗 区；散射电子能力弱，透过电子多，显示为明区，形成反差。 高原子序数的元素散射能力强；低原子序数的元素散射能力弱。 生物样品均为C、H、O、P等低原子序数的元素，反差极差。,透射电子光学像的形成,成像模式 在成像模式下，可以得到样品的形 貌、结构等信息。衍射模式 在衍射模式下，可以对样品进行物 相分析。,Object plane of the imaging lens systemImage mode:1st intermediate image planeDiffraction mode:back focal plane of the obj. lens,Back focal plane =diffraction pattern,1st intermediateimage plane,Specimen,Objective Aperture,SA Aperture,Obj. Lens,MC Lens,imaging lens system,Object plane of the imaging lens systemImage mode:1st intermediate image planeDiffraction mode:back focal plane of the obj. lens,Back focal plane =diffraction pattern,1st intermediateimage plane,Specimen,Objective Aperture,SA Aperture,Obj. Lens,MC Lens,imaging lens system,电子衍射,采用波长小于或接近于其点阵常数的电子束照射晶体样品，由于入射电子与晶体内周期地规则排列的原子的交互作用，晶体将作为二维或三维光栅产生衍射效应，根据由此获得的衍射花样，研究晶体结构。,Cr18Ni5Mo3Si2 双相不锈钢金属薄膜的选区电子衍射花样和衍射图像a铁素体及其析出相R相的明场像 b R相的暗场像 c 选区电子衍射花样,透射电镜的结构,通常透射电镜由电子光学系统、电源系统、真空系统、循环冷却系统和控制系统组成，其中电子光学系统是电镜的主要组成部分。,透射电镜的结构,电子光学系统的组成部分示意图。 由图可见透射电镜电子光学系统是一种积木式结构，上面是照明系统、中间是成像系统、下面是观察与记录系统。,透射电子显微镜光路原理图,照明系统,照明系统主要由电子枪和聚光镜组成。电子枪是发射电子的照明光源。聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。,电子枪,电子枪的必要特性是亮度要高、电子能量散布要小。目前常用的种类有热游离方式和场发射方式。不同的灯丝在电子源大小、电流量、电流稳定度及电子源寿命等均有差异。,热游离方式电子枪 利用高温使电子具有足够的能量去克服电子枪材料的功函数(work function)能障而逃离。温度和功函数影响发射电流密度，但因操作电子枪时均希望能以最低的温度来操作，以减少材料的挥发，所以在操作温度不提高的状况下，就需采用低功函数的材料来提高发射电流密度。钨灯丝(W) 价钱最便宜使用最普遍，钨的功函数约为4.5eV，操作温度约2700K，电流密度为1.75A/cm2，电子能量散布为 2eV，在使用中灯丝的直径随着钨丝的蒸发变小，使用寿命约为4080小时。六硼化镧(LaB6)灯丝功函数为2.4eV，较钨丝为低，因此同样的电流密度，使用LaB6只要在1500K即可达到，而且亮度更高，因此使用寿命比钨丝高出许多，电子能量散布为 1eV。但因LaB6在加热时活性很强，所以必须在较好的真空环境下操作，因此仪器的购置费用较高。,场发射式电子枪当在真空中的金属表面受到108V/cm大小的电子加速电场时，会有可观数量的电子发射出来，可得极细而又具高电流密度的电子束。此过程叫做场发射，比钨灯丝和六硼化镧灯丝的亮度又分别高出 10 - 100 倍，同时电子能量散布仅为 0.2 - 0.3 eV: 冷场发射式(cold field emission , FE) 热场发射式(thermal field emission ,TF) 萧基发射式(Schottky emission ,SE),电子枪,电子枪是透射电子显微镜的电子源。常用的是热阴极三极电子枪，它由发夹形钨丝阴极、栅极帽和阳极组成， 图5-13（a）为电子枪的自偏压回路，自偏压回路可以起到限制和稳定束流的作用。 图5-13（b）是电子枪结构原理图。在阴极和阳极之间的某一点，电子束会集成一个交叉点，这就是通常所说的电子源。交叉点处电子束直径约几十个微米。,灯丝,聚光镜,聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，以最小的损失照明样品，调节照明强度、孔径角和束斑大小。一般都采用双聚光镜系统，如图5-14所示。第一聚光镜是强激磁透镜，束斑缩小率为1050倍左右，将电子枪第一交叉点束斑缩小为15m；而第二聚光镜是弱激磁透镜，适焦时放大倍数为2倍左右。结果在样品平面上可获得210m的照明电子束斑。,成像系统,高性能的透射电镜大都采用5级透镜放大，即中间镜和投影镜有两级，分第一中间镜和第二中间镜，第一投影镜和第二投影镜。见图,成像系统成像系统主要由物镜、中间镜和投影镜组成。,（一）物镜物镜是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子显微镜分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其它透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，必须尽可能降低球差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。 物镜是一个强激磁短焦距的透镜，它的放大倍数较高，一般为100-300倍。目前，高质量的物镜其分辨率可达0.1nm左右。,物镜,物镜的分辨率主要取决于极靴的形状和加工精度。一般来说，极靴的内孔和上下级之间的距离越小，物镜的分辨率就越高。 为了减少物镜的球差，往往在物镜的后焦面上安放一个物镜光阑。物镜光阑不仅具有减少球差，像散和色差的作用，而且或以提高图像的衬度。 电子显微镜图像分析时，物镜和样品之间和距离总是固定不变的。因此改变物镜放大倍数进行成像时，主要是改变物镜的焦距和像距来满足成像条件。,（二）中间镜,中间镜是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在0-20倍范围调节，主要是利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。,（三）投影镜,投影镜的作用是把经中间镜放大（或缩小）的像进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角很小,因此它的景深和焦距都非常大。即使改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数有很大的变化，也不会影响图像的清晰度。,观察与记录系统,观察和记录装置包括荧光屏和照相机构，在荧光屏下面放置一下可以自动换胶片的照相暗盒。照相时只要把荧光屏竖起，电子束即可使照相底片曝光。随着数字技术及计算机技术的飞速发展，电镜图像的获得也由胶片技术向数字技术转化，通过CCD相机，可以很快的捕捉到感兴趣区域的图像，并通过计算机进行储存、图像处理等一系列的图像优化。,透射电镜的主要部件-样品台,样品台的作用是承载样品，并使样品能作平移、倾斜、旋转，以选择感兴趣的样品区域或位向进行观察分析。透射电镜的样品是放置在物镜的上下极靴之间，由于这里的空间很小，所以透射电镜的样品也很小，通常是直径3mm的薄片。,样品台与试样,透射电镜的主要部件-消像散器,消像散器可以是机械式的，可以是电磁式的。机械式的是在电磁透镜的磁场周围放置几块位置可以调节的导磁体，用它们来吸引一部分磁场，把固有的椭圆形磁场校正成接近旋转对称的磁场。电磁式的是通过电磁极间的吸引和排斥来校正椭圆形磁场的,透射电镜的主要部件-光阑,在透射电子显微镜中有许多固定光阑和可动光阑，它们的作用主要是挡掉发散的电子，保证电子束的相干性和照射区域。其中三种主要的可动光阑是第二聚光镜光阑，物镜光阑和选区光阑。光阑都用无磁性的金属（铂、钼等）制造。,（一）选区光阑,选区光阑又称场限光阑或视场光阑。为了分析样品上的一个微小区域，应该在样品上放一个光阑，使电子束只能通过光阑限定的微区。对这个微区进行衍射分析叫做选区衍射。由于样品上待分析的微区很小，一般是微米数量级。如果物镜的放大倍数是50倍，则一个直径等于50m的光阑就可以选择样品上直径为1m的区域。选区光阑同样是用无磁性金属材料制成的，一般选区光阑孔的直径位于20400m范围之间，它可制成大小不同的四孔一组或六孔一组的光阑片，由光阑支架分档推入镜筒。,（二）第二聚光镜光阑,聚光镜光阑的作用是限制照明孔径角。在双聚光镜系统中，安装在第二聚光镜下方的焦点位置。光阑孔的直径为20400m作一般分析观察时，聚光镜的光阑孔径可用200300m，若作微束分析时，则应采用小孔径光阑。,（三）物镜光阑,物镜光阑通常被放在物镜的后焦面上。常用物镜光阑孔的直径是20120m范围。电子束通过薄膜样品后产生散射和衍射。散射角较大的电子被光阑挡住，不能继续进入镜筒成像，在像平面上形成具有一定衬度的图像。光阑孔越小，被挡去的电子越多，图像的衬度就越大。物镜光阑可以在后焦面上套取衍射束的斑点（即副焦点）成像，这就是所谓暗场像。利用明暗场显微照片的对照分析，可以方便地进行物相鉴定和缺陷分析。,从聚光镜到物镜,总结,透射电子显微镜主要组成部分是照明系统、成像系统和观察记录系统。成像系统中的物镜是显微镜的核心，它的分辨率就是显微镜的分辨率。成像系统可以实现两种成像操作：一种是将物镜的像放大成像，即试样形貌观察；另一种是将物镜背焦面的衍射花样放大成像，即电子衍射分析。,总结,电镜的像差为：球差、像散、色差。其中球差不可消除（现在能消除）且对电镜分辨率影响最显著；像散可以消除；色差的影响是电压波动和样品厚度不均造成的。电子显微镜的景深和焦长都很大。,Tecnai G2 Spirit: High image quality (高画质),91,电镜的功能及发展,透射电子显微镜的功能的扩展；分辨率的不断提高；将计算机和微电子技术应用于控制系统、观察与记录系统等。,透射电子显微镜类型 球差校正电镜、超高压电镜、中等电压电镜（200kV、120kV、100kV），分析电镜，场发射透射（扫描）电镜等等；电子显微镜的附属功能拓展 三维结构重建、微区分析 生物电镜观察的对象是三维结构 (细胞或组织的超薄切片 ,病毒颗粒 ,生物大分子等) ,电镜图象仅是这些三维结构的二维投影。由生物结构的二维电镜图像推知其三维结构的方法统称为三维电镜方法。,其它型式的显微镜,扫描隧道显微镜：利用隧道电流效应原子力显微镜：利用原子力效应激光力显微镜：利用激光作用力磁力显微镜：利用磁作用力 以上各类显微镜都属于探针触摸效应方式的，而光学显微镜和电子显微镜则属于光的视觉效应方式。,原子力显微镜,原子力显微镜（AFM）是利用原子之间的范德华力（Van Der Waals Force）作用来呈现样品的表面特性。假设两个原子中，一个是在悬臂（cantilever）的探针尖端，另一个是在样本的表面，它们之间的作用力会随距离的改变而变化，其作用力与距离的关系是当原子与原子很接近时，彼此电子斥力的作用大于原子核与电子之间的吸引力作用，所以整个合力表现为斥力的作用，反之若两原子分开有一定距离时，其电子斥力的作用小于彼此原子核与电子之间的吸引力作用，故整个合力表现为引力的作用。若以能量的角度来看，这种原子与原子之间的距离与彼此之间能量的大小有关。,原子力显微镜与扫描力显微术,原子与原子之间的交互作用力因为彼此之间的距离的不同而有所不同，其之间的能量表示也会不同,AFM具有样品制备简单， 无须导电， 无须低温、真空等条件， 分辨率非常高等优势。 AFM由在空气中到液体或近生理条件下研究生物样品使得观测结果更趋近于真实现象。以 IgG抗体为例， 由于抗体分子易于变形、 分子表面水膜对分子形貌的扭曲、 探针对分子的作用力等因素的影响， 使得最初在空气中所获 IgG分子为圆形， 难以观察其亚结构。 在液体条件下， 使用AMF轻敲模式，能够获得其高分辨率图象， 可看到典型的 Y型结构 。,单个生物大分子 （如 蛋白质， 多糖， 等等）形貌观察多个分子相互作用和生化过程观察（分子间相互作用， 抗原-抗体反应 ，DNA酶对DNA的作用，DNA与抗菌素的作用，蛋白质-DNA的相互作用， 配体与受体相互作用）染色体、DNA和RNA的杂交过程， 蛋白质的运动 ， 有丝分裂过程， 细胞的运动、 分裂、 集聚和凋亡 过去研究的生物大分子均是经分离、 提纯所得， 近期则对细胞膜表面的分子进行观察。由于细胞尺寸较大， 细胞表面非常柔软， 且细胞表面蛋白成分非常复杂， 将是 AMF应用于细胞生物学的主要发展方向。,原子力显微镜的应用：,在原子力显微镜中也利用斥力与吸引力的方式发展出两种操作模式： （1）利用原子斥力的变化而产生表面轮廓为接触式原子力显微镜（contact AFM ），探针与试片的距离约数个。 （2）利用原子吸引力的变化而产生表面轮廓为非接触式原子力显微镜（non-contact AFM ），探针与试片的距离约数十个 到数百个。,原子力显微镜的硬件架构,原子力显微镜(AFM)系统结构,在原子力显微镜的系统中，可分成三个部分：力检测部分位置检测部分反馈系统。,二极管激光器发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂背面，并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位置检测器。在样品扫描时，由于样品表面的原子与微悬臂探针尖端的原子间的相互作用力，微悬臂将随样品表面形貌而弯曲起伏，反射光束也将随之偏移，因而，通过光电二极管检测光斑位置的变化，就能获得被测样品表面形貌的信息。,接触模式,横向力,轻敲模式,肌动蛋白体外自组织复合纤维结构的观察 激光生物学报 2004 Vol . 13 No. 6张军, 王远亮, 何创龙,目的利用原子力显微镜(atomic force microscope , AFM) 和透射电子显微镜(transmission electron microscope , TEM) 技术,研究了低浓度肌动蛋白在体外简单热力学体系中,形成的自组织复合纤维结构。方法提取自牛骨骼肌, 分离的肌动蛋白达电泳单点纯,然后将样品置于37 恒温箱中孵育30 min 使其聚合。聚合完成后,在新鲜剥离的、经F2缓冲液浸润的云母表面滴加5l 待测溶液,使蛋白能够良好分散。沉降15min 后,自然脱水以尽可能维持肌动蛋白真实的聚合结构,制成待测样品。样品制备完成后不经过任何物理和化学处理,立即在室温下(25 ) 用原子力显微镜的接触模式成像。上述所有操作均在超净工作条件下进行,以避免污染。,结果肌动蛋白在体外通过自组织能够聚合形成大尺度的树状分支纤维丛结构和聚集的、相互缠绕的无规卷曲纤维簇。目前初步判断,观察到的聚集结构可能是由微丝通过非共价作用(氢键,范德华力,静电作用等等) 进一步聚合形成的有序结构;推测微丝间的相互缠绕形成(多级) 螺旋可能是聚集纤维复合体的主要构成方式。,具有分形结构特征的树状分支结构,由多级纤维分支形成,人舌鳞癌组织超薄切片的AFM成像和切割 电子显微学报 Vol 222 ,No 12 李鑫辉 ,季彤 ,张晓东 ,张陈平,制备的切片在AFM下可以达到亚细胞水平分辨率,能用于研究细胞内部的结构。在成像的基础上,利用AFM针尖对肿瘤细胞核内的特定区域进行切割和操纵。因为针尖与样品表面的作用力大小可以精确控制,因此这种切割可以在纳米尺度上精细定位,经操纵之后形成生物分子堆积,为后续的分离和拾取及进一步用分子生物学手段在亚细胞基因水平研究1 材料和方法111 病例和取材选取15 例取自经病理确诊为舌鳞癌病人的肿瘤中央区组织作为病变组,另取10 例目视无病变的癌旁正常鳞状上皮组织作为对照。112 固定和包埋将标本在冷的2 %戊二醛固定液固定后, 经0.1/molPBS 缓冲液冲洗,乙醇梯度脱水,在环氧丙烷中过渡,用环氧树脂618 包埋。113 切片和观察包埋块修整后在LKB 2088 型超薄切片机上切片,半薄切片定位之后,对感兴趣的典型部位超薄切片,选择银白色的片子,捞取后沉积在新解离的云母上, 干燥后用Nanoscope IIIa 型AFM,在空气中观察。,结果,图1a 所示,可以看到树脂切片表面均匀平整,任意作切面观察,发现环氧树脂颗粒大小起伏在几个纳米之间。说明环氧树脂618 与两种酸酐固化剂,即十二碳烯琥珀酸酐(DDSA) 和甲基内次甲基四氢苯二酸酐(NMA) ,以及胺加速剂2 ,4 ,6 三(二甲氨基甲基) 苯酚(DMP230) 共四种物质固化交联形成的三维结构非常均匀、高度稳定,颗粒很小,适合AFM 观察,并且环氧树脂渗透性好,固化时不产生大的收缩,对光、热和氧稳定。图1b 显示的是癌巢中心组织细胞形态。细胞大小不一,形态多样,核固缩,异型明显,核膜内陷,核区明显比胞浆区亮。提示核区硬度大,与相对疏松的胞质区域相比可能更难以被刀切开。造成核区硬度大的原因是染色质活跃,形成了一个相对密实的区域,于是高度亦较胞质区为甚。作切面可以得知组织起伏比环氧树脂本身大得多,在几十纳米之间。,结果,环氧树脂和人舌鳞癌组织超薄切片表面AFM微观形貌和截面结构。(a) 环氧树脂,表面很平整,起伏在几个纳米;(b) 舌鳞癌组织,显示细胞形态异常,核大而胞质相对较少。,人舌鳞癌细胞的AFM亚细胞结构。a :显示细胞间分散,彼此联系不紧密,有一个巨大的畸形核,核膜清晰,严重内陷,核区较亮,部分高亮的斑块可能是DNA 复制或转录活跃的区域。b :显示核膜内陷的一个大核,右上角的局部放大图显示核膜的局部。,利用AFM针尖切割和操纵人舌鳞癌细胞核内生物分子。a :切割示意图;b :显示的是人舌鳞癌组织癌巢内中心;c :对癌巢内某个细胞的核内特定区域进行纳米水平切割和操纵,堆积形成一高亮的生物分子团块;d :为图c 的局部放大。,AFM 在观察的同时还可以对生物组织的超薄切片进行纳米尺度的“纳米切割”,可以收集所需要部分进行一系列分子生物学的实验。从“微切割”到“纳米切割”将无疑会进一步推动生物医学的研究。,高分辨透射电子显微镜,透射电子显微镜发展的另一个表现是分辨率的不断提高。目前200KV透射电子显微镜的分辨率好于0.2nm，1000KV透射电子显微镜的分辨率达到0.1nm，可测定出分辨率约0.1nm的晶体结构。透射电子显微镜分辨率的提高取决于电磁透镜的制造水平不断提