smart技术ppt课件

.,1,SMART技术,.,2,背景介绍,真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3末端都带有一段PolyA，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。,.,3,技术历程,常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。,.,4,SMART(SwitchingMechanismAt5endoftheRNATranscript(SMART)技术的出现是一个新的里程碑。原理：在合成cDNA的反应中事先加入的3末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。,.,5,这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。,.,6,几个采用SMART技术的产品（Clontech）,SMARTPCRcDNASynthesisKitSMARTcDNALibraryConstructionKitSMARTRACEcDNAAmplificationKitCreatorSMARTcDNALibraryConstructionKitAltasSMARTProbeAmplificationKitSuperSMARTPCRcDNASynthesisKit,.,7,SMARTPCRcDNASynthesisKit,功能：由ng级的RNA的到高质量的cDNA文库选择性得到新的带5端的全长cDNA用LD连接介导的PCR产生全长cDNA可与CreatorTM表达系统配套使用这个试剂盒是采用SMART技术将少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA制备成可大量扩增的cDNA。,.,8,试剂盒提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一链Buffer、dNTP、DTT、AdvantagePCRKit(15rxns)和纯化cDNA用的纯化柱和对照RNA在内的试剂。首先利用专利的SMARTTM寡聚核苷酸合成第一链，再利用LDPCR技术生产高质量的全长cDNA双链。比较传统的Gubler&HoffmancDNA合成法，SMART技术能得到更高比例的全长克隆，得到完整的mRNA5端非编码区。,SMARTPCRcDNASynthesisKit,.,9,SMARTPCRcDNASynthesisKit,在SMART技术中，第一链合成一个经修饰oligo(dT)引物-CDSIIprimer(SfiIB),而SMARTII寡核苷酸(SfiIA)作为mRNA5端延伸出去的模版。当反转录到达mRNA5端时，反转录酶跳移并继续反转录至SMARTII寡核苷酸的末端，这种跳移常常发生在真核生物mRNA的帽子结构-m7G。这样反转录出的cDNA包含mRNA完整的5端以及SMARTIII寡核苷酸互补序列，而SMARTII寡核苷酸用作接下来扩增反应的引物，只有含有全长mRNA和SMARTII寡核苷酸的序列才能在PCR反应中扩增出来。合成过程见下页图片,.,10,SMARTPCRcDNASynthesisKit,.,11,SMARTPCRcDNASynthesisKit,CDSII引物是含有经过修饰的Oligo（dT）的起始引物，能特异结合在mRNA加PolyA的位置，避免结果有过长的PolyA影响后继的测序或者PCR反应，同时也可以作为PCR的3引物。合成的cDNA可以直接进行对数扩增或者线性扩增，可以作为定量PCR的模板，也可以直接用于Clontech的抑制性消减杂交，构建cDNA文库或者做反向Northern杂交（VirtualNorthernBlot），还有用于芯片检测的cDNA探针制备。,.,12,SMARTcDNALibraryConstructionKit,常规建库方法缺陷：常规的建库需要在合成的cDNA双链两端通过连接加上相同或者不同的adaptor，用相应的酶切后可以插入载体中。由于连接效率低往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的代表性。在做表达文库时，如果cDNA的两端是同一个酶切位点，由于cDNA可能按两个不同的方向接入载体，反向接入载体的那些cDNA不能正确表达，因而有50%的可能丢失。然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶切是否完全的问题，影响产率。另外由于表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。,.,13,SMARTcDNALibraryConstructionKit,利用SMART技术建库，可以得到全长的cDNA文库，也不需要Adaptor的连接。这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同，分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。SfiI是一个在真核生物基因组中极为稀少的酶，出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。SfiI识别序列为GGCCNNNNNGGCC，中间的5个碱基为任意序列。因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切，得到的是两端的粘端不同的cDNA，这样就可以定向插入特定的载体中，不会浪费50%的信息。,.,14,这个试剂盒提供的载体也很有特色：双链cDNA与噬菌体载体lambdaTriplex2的左右臂连接后再与包装蛋白进行包装反应，进而侵染大肠杆菌形成cDNA文库。lambdaTriplex2载体即具有噬菌体载体的优点-高滴度文库，蓝白斑筛选，表达量的调节，