微生物限度检查法操作规程.doc

文件编号 SOP-QC-605 版号 B 页码1/6 1.目的 建立微生物限度检查法操作规程。 2.适用范围 本规程适用于原辅料、 包装材料、 制剂（非规定灭菌）、 药妆、 空气洁净等各类微 生物限度检查。 3.编制依据 中国药品检验标准操作规范2010年版 中华人民共和药典2010年版二部 药品微生物学检验手册 4.责任 4.1 QC 质检员对本规程的实施负责。 4.2 QC 主管对本规程的有效执行承担监督检查责任。 5.正文 5.1 微生物限度检查系指非规定灭菌制微生物污染限度的一种检查方法，包括活菌数及 控制菌的检查。 5.2 药品生产洁净室（区）的空气洁净划分为四个级别，不同级别间微生物最大允许 数、尘粒最大允许数不同。 洁净级别尘粒最大允许数/立方米微生物最大允许数 0.5um5um浮游菌/立方米沉降菌/皿 100级3500051 10000级35000020001003 100000级35000002000050010 300000级1050000060000100015 5.3 微生物限度检查室和操作人员的一般原则 5.3.1 检查的全部过程均应严格遵循无菌操作，防止再污染。 5.3.2 进入微生物限度检查室的操作人员，面部暴露部位不得化妆；患传染病及体表有 伤口人员禁止入内。 5.3.3 操作人员进微生物限度检查室前应在缓冲间用规定的消毒液进行手部消毒，更衣， 戴帽，戴口罩及换鞋，进入微生物限度检查室后，再用75%酒精消毒手部。 5.3.4 使用净化工作台前，应先用规定的消毒液（3 月轮换一次）擦工作台与各操作开 关，然后开紫外灯及空气过滤器30 分钟后，方可使用。物品通过传递窗进入。 5.4 培养基及供试液的制备 文件编号 SOP-QC-605 版号 B 页码2/6 5.4.1 培养基的制备方法 5.4.1.1 细菌培养基：称取营养琼脂培养基 34g，加 1L 纯化水溶解，115灭菌，40 分 钟后，备用。 5.4.1.2 霉菌培养基：称取虎红琼脂培养基 30g，加 1L 纯化水溶解，115灭菌，40 分 钟后，备用。 5.4.1.3 控制菌的培养（详见中华人民共和国药典2010 版二部）。 5.4.2 器皿的准备：直径 90ml 的平皿，10ml、1ml 的刻吸管，200ml 的三角烧瓶及胶 塞等，均应包扎好后，再经121高压蒸气灭菌30 分钟。 5.4.3 供试液的制备方法： 5.4.3.1 液体供试品：取供试品 10ml，加入 90ml的稀释剂中，混匀，作为供试液； 5.4.3.2 固体、半固体或粘稠液供试品：称取供试品10g，置pH7.0蛋白胨-氯化钠无菌 缓冲溶液 100ml 中，混匀后，作为供试液。制成供试液后，应尽快稀释，注入平皿，在 1 小时内操作完毕。 5.4.3.3 非水溶性供试品：取供试品 5g，加入含溶化（温不过 45）的无菌司盘 80 5g、单硬脂酸甘油酯 3g、聚山梨酯-80 10g无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成 团后，慢慢加入 45左右的 pH7.0 蛋白胨-氯化钠无菌缓冲溶液 80ml，边加边搅拌， 使供试品充分乳化，作为供试液（1:20）。 5.4.3.4 复合管及塑瓶加入按供试品容积适当加入一定量 pH7.0 蛋白胨-氯化钠无菌缓 冲溶液，振摇1 分钟，得供试品溶液。 5.4.3.5 其他按数量 10 个（支）或面积（接触药品面）100 cm2浸没于 30ml pH7.0 蛋 白胨-氯化钠无菌缓冲溶液，振摇一分钟，得供试品溶液。 5.5 测定方法： 5.5.1 细菌、霉菌及酵母菌的检测： 5.5.1.2 平皿菌落计数法：取供试液各 1ml，加入 90 毫米的平皿中，（每个稀释应 作细菌、霉菌，各2 个平皿）。每个平皿加15-20ml已融化并冷至45的培养基，快速 摇匀，待凝后，倒置进行培养。同时各做一个空白对照。 5.5.1.3 薄膜过滤法：取相当于 1 克或毫升供试品的供试液，加至适量的稀释级中，混 匀，用 pH7.0 蛋白胨-氯化钠无菌缓冲溶液冲洗滤膜，冲洗时应注意保持供试品的溶剂 及冲洗液覆盖整个滤膜表面。冲洗量不宜过大，每张滤膜每次冲洗量约为100毫升，取 出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上。同时做一个空白对照。 文件编号 SOP-QC-605 版号 B 页码3/6 5.5.1.4 培养： 细菌 30-35培养3天，计菌落数； 霉菌25-28培养 5 天，计菌落数； 空白对照应无菌生长。必要时延长培养时间为7天 5.5.2 控制菌的检查：除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品 1g、1ml、10cm2） 直接或处理后接种，经增菌、分离培养（均为 30-35）后，进行革兰染色，鉴定试验 与血清凝集试验等检查。 5.5.3 大肠杆菌 5.5.3.1 对照用菌液：对照菌株为大肠杆菌C 毫米 CC（B）44102，取大肠杆菌营养琼 脂培养斜面新鲜培养物-白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养 18-24 小时后， 稀释至 1:1000000，对照菌的加入量含菌为50100 个。 5.5.3.2 检查大肠埃希氏杆菌 5.5.3.2.1 取胆盐乳糖培养基 3份，每份 100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中 1 份加入对照菌50100 个作阳性对照，第 3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。 培养 18-24 小时，必要时可延至48 小时,阴性对照应无菌生长。 5.5.3.2.2 分离培养：将上述增菌培养液及供试液阳性对照培养液轻轻摇动，以接种环 沾取 1-2 环培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养 18-24 小 时，当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品的平板无菌浇生长，或有菌落但不 同于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板上所培养菌落形态特征的，可判为未检出 大肠埃希氏杆菌。 当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠埃希氏杆菌，应研究原因， 重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。 5.5.3.2.3 纯培养：如生长菌落与曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板上所培养菌落 形态特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的中心，沾取培养物，应挑 选 2-3 个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团， 应沾取疑菌少许，重新划线于 EMB 琼脂平板，培养 18 小时，再挑选单个疑似菌落，做 以下检查。 5.5.3.2.4 革兰氏染色、镜检： 5.5.3.3.4.1取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物做革兰氏染色（见药品微生物 学检验手册第25 章微生物的形态学检查法）。 5.5.3.3.4.2镜检：革兰氏阳性菌呈蓝色，革兰氏阴性菌呈红色。 文件编号 SOP-QC-605 版号 B 页码4/6 5.5.3.2.5 鉴定试验（见药品微生物学检验手册第8 章大肠埃希氏杆菌检查法） 5.5.3.3 结果判断见表。对与 MUG-1 反应不符的可疑菌株，应重新分离培养，再作生化 试验证实。 MUGR 结果判断 MUG-1曙红亚蓝琼脂IMVic结果 + +检出大肠杆菌 未检出大肠杆菌 + 无菌生长未检出大肠杆菌 + 有菌生长 + （1）检出大肠杆菌 +有菌生长+ + （2）检出大肠杆菌 注：（1）（2）出现如（1）+ + 或（2）出现 + ，均应重新 分离菌株，再作MUG-1 和IMVic 试验。 5.5.4 大肠菌群：取供试品溶液 1:10，1:100 样品稀释液各 1.0 毫升分别注皿，每个稀 释级个 2 个平皿，加入溶化丙冷却至 45的乳糖葡萄糖结晶紫中性红胆琼脂或其他鉴 定大肠菌群的特征性琼脂培养基 15 毫升，摇匀，平放，待凝固，再加 3-5 毫升 VRB 琼 脂或其他鉴定大肠菌群的特征性琼脂培养基覆盖，同时取 1 毫升 pH7.0 蛋白胨-氯化钠 无菌缓冲溶液于无菌平皿内，加 15 毫升 VRB 琼脂或其他鉴定大肠菌群的特征性琼脂培 养基覆盖，作阴性对照，待凝固后将平皿倒置 30-35培养 18-24 小时，点计同一稀释 级 2 个培养皿的菌落数，大肠菌落的典型特征为直径 1-2 毫米，黑暗红色，有红色胆 盐沉淀圈或其他特征性菌落，阴性对照无生长。求出个稀释级2个平皿的菌落平均数， 乘以稀释倍数，这个数字为1 克或毫升供试品所含大肠菌群数。 5.5.5 铜绿假单胞菌 5.5.5.1 对照用菌液：取绿脓杆菌CMCC（B）10104 营养琼脂斜面培养物少许，接种 到营养肉汤培养基内，于 30-35培养 18-24 小时后，用 pH7.0 蛋白胨-氯化钠无菌缓 冲溶液稀释至1:1000000，使对照菌加入量含菌50-100 个（一般用量为0.1ml）。菌落 在做阳性对照实验的同时用营养琼脂平板法计数确定。 5.5.5.2 增菌培养：取胆盐乳糖培养基 3 瓶，每瓶 100ml，2 瓶分别加入 1:10 供试液 10ml（相当于供试品 1g 或 1ml），其中一瓶加入对照菌 50-100 个作为阳性对照。第三 瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照，于 30-35培养 18-24 小时。阳性对照应生 长良好，阴性对照应无菌生长。 5.5.5.3 分离培养：取上述增菌培养液摇匀，以接种环沾 1-2 环培养液（如有菌膜应取 之），划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，于 30-35培养 18-24 小时。绿脓杆 文件编号 SOP-QC-605 版号 B 页码5/6 菌在该培养基平板的典型菌落为扁平、圆形或无定形，边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色。 周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有相融现象。菌落周围有水溶性蓝绿色素扩散，使 培养基显蓝绿色。 当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品平板无菌落生长或无疑似菌落生长， 可判为供试品1g 或1ml 未检出铜绿假单胞菌。 5.5.5.4 纯培养：供试品分离平板生长所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接 触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选 2-3 个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜 面，培养，做以下检查。 5.5.5.5 革兰氏染色、镜检： 5.5.5.5.1 革兰色染色 5.5.5.5.2 镜检：绿脓杆菌为革兰阴性，无芽胞杆菌、单个、成对或成短链排列。 5.5.5.6 鉴定试验（见药品微生物学检验手册第3章） 5.5.6 金黄色葡萄球菌 5.5.6.1 取亚硝酸钠肉汤培养基 3 份，每份 100ml，2 份加入规定量的供试液，其中 1 份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作为阴性对照。均培 养 18-24 小时（必要时可延长至48 小时）。阴性对照应无菌生长。取其作2份培养液划 线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板或甘露醇高盐琼脂培养基平板，培养 24-72 小时， 当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌生长，或有勤务落但不同于 表所列特征，可判未检出金黄色葡萄球菌。 培养基菌落形态 卵黄高盐琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳油圈，菌 落直径 1-2毫米 甘露醇高盐琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色外环，菌落直径 0.7- 1 毫米 5.5.6.2 如有菌落生长并与表所列特征相符时,应选择 2-3 个菌落,分别接种于营养琼脂 培养物革兰染色,并作血浆凝固酶试验。 文件编号 SOP-QC-605 版号 B 页码6/6 5.5.6.3血浆凝固试验 :取灭菌小试管 3支,各加入血浆：无菌水 (1:1)0.5ml，1 支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，作阳性对照；另一支加入 营养肉汤或 pH7.0蛋白胨 -氯化钠无菌缓冲溶液 0.5ml作阴性对照。将 3管同时培养。 3 小时后开始检查，以后适当时间逐次观察直至 24 小时。阴性对照管的血浆流动自 如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和阴性对照管任何 一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。当阴性对照和阳性对照符合要求，供 试品的菌株为革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性时，判定为检出金黄色葡萄球菌。 5.5.7白色念珠菌：取沙氏葡萄糖液体培养基 3份，每份 100ml，两份加入规定量供 试液，其中 1 份加入对照菌液作为阳性对照，第3 份加入与供试液等量的稀释液作 为阴性对照。均培养 48-72小时。阴性对照应无菌生长。取其作2 份培养液划线接 种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，培养 24-48小时（必要时可延长至72 小时），当 阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌生长，或有菌落但不同于表所 列特征，可判未检出白色念珠菌。如相符或疑似，应用显色培养基培养 24-48小时， 必要时延长至 72 小时，看菌落是否为绿色或翠绿色菌落，不是则判未检出，若为绿 色或翠绿色，则在1% 聚山梨酯 -80- 玉米琼脂培养基上培养 24-48小时，染色镜检， 若为非革兰氏阳性，未见厚膜孢子，假菌丝牙管，则判未检出。 5.5.8结果判定：检验结果的报告以 1g 、1ml、10