紫杉醇的分离与纯化.doc

摘要目的：探索红豆杉中紫杉醇的提取纯化工艺。方法：将新鲜的红豆杉树皮干燥后用甲醇浸泡，陶瓷膜进行固液分离，纳滤膜浓缩，再用大孔树脂HZ818层析，洗脱液浓缩结晶，再活性炭脱色后甲醇重结晶，再硅胶正向层析，洗脱液浓缩后正已烷结晶，再真空干燥得成品。结论：按本方法从红豆杉中提取的紫杉醇纯度为97.5%，收率为十万分之八。 关键词 红豆杉，紫杉醇，提取纯化，树脂，硅胶 目录 一、紫杉醇目前的一些分离纯化方法。5（一）液相萃取。5（二）固相萃取法。5（三）树脂层析法。5（四）活性炭脱色。5（五）硅胶正向层析。5（六）结晶纯化。5（七）其他技术手段。5二、实验材料与仪器6（一）原料与试剂。6（二）分析。6三、工艺流程。6四、试验过程与结果。7（一）原料前处理。7（二）甲醇浸泡提取及固液分离。7（三）纳滤浓缩。7（四）大孔树脂HZ818层析。7（五）大孔洗脱液浓缩结晶。8（六）活性炭脱色再甲醇重结晶。8（七）硅胶正向层析。8（八）正已烷结晶。9（九）真空烘干。10五、结论11六、参考文献11 引言 全世界60亿人口中，每年约新增800万癌症患者，600多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。癌症严重地威胁着人类的生命和健康，因此寻找有效的抗癌药物成为研究的热点。早在1958年美国癌症协会就发起一项历时20余年、筛选35000多种植物物种提取物的计划。在计划实施过程中，1963年美国化学家瓦尼和沃尔首次从生长在美国西部大森林中称太平洋杉中分离到了紫杉醇的粗提物。并发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性。由于该活性成份含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇。1992年12月紫杉醇被FDA批准上市，目前紫杉醇已成为世界公认的强活性广谱抗癌药物。然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物1。红豆杉资源：紫杉又名红豆杉、赤柏松，为紫杉科紫杉属长绿针叶乔木，是世界珍稀濒危物种，国家一级保护植物。因其药用价值巨大，世界各国将其列为“国宝”，素有“植物黄金”之称，是提取紫杉醇的天然原料2。紫杉醇主要存在于红豆杉树皮和针叶中，大约为0.010%0.020%。紫杉醇是从红豆杉属植物中分离纯化得到的天然抗肿瘤药物 ，其化学名为5,20-环氧-1,2,4,7,10,13-六羟基紫杉醇烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-（2R. 3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯 分子式：C47H51NO14 ; 分子量：853.89 理化性质：针状结晶（甲醇一水），熔点：213-216（分解），20D-49（甲醇）。可溶于甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷，三氯甲烷等有机溶剂，难溶于水（在水中溶解度仅为0.006mg/ml），不溶于石油醚。与糖结合成苷后的水溶性大大提高，但在脂溶性溶剂中溶解性降低3。一、紫杉醇目前的一些分离纯化方法：（一）、液相萃取 溶剂萃取法常用于紫杉醇的粗提阶段，通常先用甲醇、 乙醇、 甲醇：二氯甲烷(11)浸提, 除去溶剂后所得的浸膏用 CH2Cl2- H2O 或 CHCl3-H2O 萃取, 这样的提取方法获得的浸膏含有较多的杂质4。杨宪等人在紫杉醇提取工艺的优化研究中对乙醇萃取进行了充分研究。5（二）、固相萃取法 固相萃取法(SPE)作为一种新型萃取方法，具有节省时间、降低溶剂用量、提高选择性和收率的优点，主要被用来除去与紫杉醇极性相差较大的杂质。所用填料主要有硅胶、氧化铝和C18反相硅胶。陈振德6等以红豆杉科榧属植物(Torreya)的假种皮为原料，直接对乙醇提取物进行硅胶柱层析，降低了制备紫杉醇的成本，扩大了其原料的来源，且保护了植物资源。而Mathina用C18固相提取法从粗提物中大量分离收集紫杉烷类化合物，在实际紫杉醇制备工艺中，液一液萃取法和固相萃取法多串联使用，通常的做法是将液一液萃取法置于固相萃取法之前，因为植物提取物中杂质含量数万倍于紫杉醇，若用SPE直接处理提取物，将不仅降低紫杉醇的处理量、加重填料的回收负荷、缩短填料的使用寿命，并且，因传质阻力大，固定相对紫杉醇的吸附不彻底，会增大紫杉醇的损失。（三）、树脂层析法 近年聚苯乙烯型树脂被较多的应用到紫杉醇的前处理中，用于去除色素等杂质，因为紫杉醇是二萜类化合物，具有多环结构，容易被带苯环的吸附剂特异性吸附。元英进7等的研究结果表明，聚苯乙烯型强碱树脂(PsA)及多乙烯多胺一环氧氯丙烷缩聚型弱碱树脂(PcA)对二氯甲烷粗提物的吸附及脱色性能较好，有望用于紫杉醇的纯化分离。郭立佳等人采用HZ818大孔吸附树脂对红豆杉浸膏中的紫杉醇成分进行吸附和洗脱试验，确定了其最佳工艺参数。8（四）、活性炭脱色 活性炭可有效的脱除其中的色素，为后序分离工作减轻负担， 吕秀阳等在紫杉醇提取工艺的放大与优化对该方法进行了研究9。（五）、硅胶正向层析 正相层析是指流动相的极性小于固定相，层析过程中，极性小的物质先被洗出，极性大的物质后洗出。郭力佳在紫杉醇分离纯化工艺的研究中对层析条件进行了实验10。（六）、结晶纯化 常用的结晶方法有甲醇-水、正己烷等结晶，紫杉醇不溶于水因此可通过向甲醇液中加水的方法结晶出紫杉醇白色针状结晶9，紫杉醇在正己烷中可以沉淀析出淡黄色晶体11.（七）、其他技术手段：1、无机陶瓷膜分离技术 无机陶瓷膜分离技术是基于多孔陶瓷介质的筛分效应而进行的物质分离技术，采用与传统“死端过滤”“滤饼过滤”等过滤方式截然不同的动态“错流过滤”方式：即在压力驱动下，原料液在膜管内侧膜层表面以一定的流速高速流动，小分子物质（液体）沿与之垂直方向透过微孔膜，大分子物质（或固体颗粒）被膜截留，使流体达到分离浓缩和纯化的目的。2、纳滤膜浓缩技术 是允许溶剂分子或某些低分子量溶质或低价离子透过的一种功能性的半透膜。它是一种特殊而又很有前途的分离膜品种，它因能截留物质的大小约为纳米而得名，它截留有机物的分子量大约为150500左右，截留溶解性盐的能力为298%之间，对单价阴离子盐溶液的脱盐低于高价阴离子盐溶液。二、实验材料与仪器（一）原料与试剂原料 红豆杉树皮 杭州海正药用植物有限公司种植基地 乙醇 工业级 国药集团化学试剂有限公司HZ818树脂 试剂级 上海华震科技有限公司颗粒活性碳 分析纯 沈阳市试剂二厂柱层析硅胶 100一160目 青岛海洋化工厂分厂氯仿 分析纯 宜兴市展望化工试剂厂甲醇 分析纯 无锡市龙吉利化工试剂有限公司正已烷 分析纯 国药集团化学试剂有限公司紫杉醇标样 97 SigmaKQ-100DE 数控超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司产品Re-52AA 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂产品 循环水式多用真空泵 郑州市长城科工贸有限公司产品SHA-C 恒温水浴振荡器 常州市国华电器有限公司产品J FSD-100 粉碎机 上海嘉定粮油仪器有限公司产品HL-2 恒流泵 上海青浦泸西仪器厂产品（二）分析采用TLC和HPLC二种方法分别进行定性和定量分析. 12TLC采用青岛海洋化工厂生产的GF254硅胶板,展开剂为:氯仿甲醇,其中甲醇为5%(VOL),标样的展开系数Rf(紫杉醇)为0.61.HPLC分析采用Waters公司的高效液相色谱系统,条件如下:柱子-氰基硅胶柱(4.6mm I.D.*250mm,Inertsil)流动相-甲醇:乙氰:水=20:26:54(VOL),流速-1.0ml/min检测-UV 227nm三、工艺流程原料前处理甲醇浸泡提取及固液分离纳滤浓缩大孔树脂HZ818层析大孔洗脱液浓缩结晶活性炭脱色再甲醇重结晶硅胶正向层析正已烷结晶真空烘干四、试验过程与结果（一）原料前处理将新鲜的原料晒2-6天七成干后，再置于通风阴凉处阴干，然后粉碎，由于紫杉醇具有热敏性，粉碎室内的温度一般不能超过60，因而采用功率和容量尽量大的粉碎机，粉碎的粒度以40目左右为宜，经抽样检验紫杉醇的平均含量为0.015%（wt）（二）甲醇浸泡提取及固液分离由于紫杉醇在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶13。本试验采用了甲醇浸泡提取，在原料中加入3倍甲醇作为起始浸泡，考虑到传统的浸提方法存在过滤时间较长，劳动强度较大，本试验无机陶瓷膜分离，浸提液从微孔膜透出，而固体颗粒被截留，同时不断加入甲醇（可用纳滤透出甲醇），维持起始体积，紫杉醇不断的被透出，直到浸提出95%的紫杉醇为止。（三）纳滤浓缩传统的减压浓缩需要加热，而紫杉醇具有热敏性，因此本试验采用了纳滤膜浓缩技术，选用分子量为200的有机膜芯，甲醇透过膜，而紫杉醇被截留，随着甲醇的不断透出，浸提液得到了浓缩，浓度达到约为25 ug/ml结束（取少量，将溶剂蒸发干后测含量为1.1%），收率为98%。（四）大孔树脂HZ818层析141、树脂预处理与再生大孔树脂用体积分数95%的乙醇浸泡24h,使其充分溶胀，湿法装柱，然后用树脂柱2倍体积的体积分数95%的乙醇以2BV/h流速的通过树脂层，并浸泡4h，用蒸馏水以2BV/h的流速洗柱3-5 BV至无乙醇，再用2BV质量分数5%的盐酸以6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4h，后用蒸馏水以同样的流速至洗出液呈中性，再用2BV质量分数2%的氢氧化钠以6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4h，最后用蒸馏水以同样的流速洗至流出液呈中性备用。再生时用甲醇充分淋洗树脂层至流出液澄清，再用蒸馏水洗至流出液呈中性备用。2、上柱液制备将甲醇浸提浓缩液用水稀释至40%的甲醇水溶液供上柱试样，样品浓度约为10ug/ml.3、层析最佳条件根据文献，用HZ818树脂层析的最佳条件为：样品浓度10ug/ml的40%甲醇水溶液作为上柱液，按1000 ug/ g树脂上样，1.5倍柱体积的上样流速，体积分数75%的甲醇淋洗，体积分数85%的甲醇洗脱，洗脱流速为1倍柱体积，洗脱体积为6倍柱体积。4、层析结果树脂层析前后对照图经试验，洗脱液浓度为160 ug/ml，样品含量达到了10.5%，提高了约10倍，收率为92%。出峰时间在13min之前的物质基本被去除，样品颜色也变为淡黄色。（五）大孔洗脱液浓缩结晶由于紫杉醇不溶于水，因此将洗脱液减压浓缩，温度控制在45以下，随着甲醇的蒸发，开始有晶体析出，然后转至冰箱4放置24h后，过滤得结晶品。（六）活性炭脱色再甲醇重结晶121、装柱 用一根直径为8cm,高为60 cm的柱子进行脱色试验,将粗品溶于甲醇中（1g粗品溶于60ml甲醇）,以3-4ml/min的流速流过经水洗、甲醇洗的活性碳柱子，按每克浓缩物脱色需3g活性碳处理。2、重结晶由于紫杉醇不溶于水，因此可通过向脱色流出液中加水的方法结晶出紫杉醇，加水量随溶液中产物的浓度不同而变化，应控制在溶液微显混浊时停止加入，静置一夜后可得淡黄色针状结晶过滤得重结晶品。3、重结晶结果经重结晶后的紫杉醇含量为90.5%，从洗脱液至重结晶的回收率为75%。（七）硅胶正向层析151、硅胶使用前的处理将层析使用的硅胶在120下真空干燥6个小时除去结合的水，用三氯甲烷浸泡2-4小时，超声波脱气5min除去其中的气泡，装15200mm柱。三氯甲烷充分洗去硅胶中残留的杂质。2、硅胶层析方法根据样品溶于少量三氯甲烷上样(进料量3mg样品/g硅胶)，吸附半小时，三氯甲烷充分淋洗，淋洗剂进一步洗柱，最后洗脱剂进行洗脱，收集馏分。2BV氯仿、1Bv 99：1氯仿甲醇淋洗，lBv 98：2氯仿甲醇洗脱，流速控制在1.5ml/min,检测前期用TLC定性，在有效主份洗出后用HPLC检测紫杉醇的纯度并计算回收率。3、硅胶层析结果硅胶层析前期TLC图硅胶层析前后对照图经硅胶层析后，紫杉醇回收率为91，纯化达到95%。（八）正已烷结晶利用紫杉醇在正己烷中可以沉淀析出这一特性，在硅胶洗脱液中加入10倍体积的正己烷沉淀结晶，过滤分离得到白色晶体，纯度为97.5%，回收率为90%。正己烷结晶后图谱（九）真空烘干将紫杉醇湿晶体放入真空干燥箱烘干，控制温度在40以下，除去湿品中的各种溶剂，直至恒重。五、结论（一）、成功地设计了一条紫杉醇分离与纯化的工艺路线。（二）、通过本方法从红豆杉树皮中提取的紫杉醇，纯度达到了97.5%，收率为十万分之八。六、参考文献1、郑德勇,余分明,陈清松等.福建南方红豆杉提取紫杉醇初探.福建林学院学报,1998,18 (2):1052、王文芝.西藏红豆杉中紫杉醇及相关紫杉烷含量的高效液相色谱分析.色谱,1997,15 (3):2243、吉前华. 红豆杉的研究与开发J. 热带农业科技. 2004(02)4 、祝顺琴，谈锋，唐克轩等 紫杉醇提取纯化技术研究进展 中国|生化药物杂志 1005一1678（2004)01-0059-045 、杨宪，杨水平，张雪，谭劼， 紫杉醇提取工艺的优化试验研究 第三军医大学学报1000-5404(2007)19-1886-036 、陈振德，郑汉臣