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第三章 基因工程的酶学基础第三章 基因工程的酶学基础第一节 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease）一、限制性核酸内切酶的发现 早在五十年代初，两个研究小组几乎同时发现了两种不同来源的l噬菌体（lK和lB）能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞（K株和B株），但当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，则感染频率普遍下降数千倍。一旦lK噬菌体在B株中感染成功，由B株繁殖出的lK后代在第二轮接种中便能象lB一样高频感染B株，但却不再有效地感染它原来的宿主K株。这种现象称为宿主细胞的限制和修饰作用，它广泛存在于原核细菌中。 1960s，Linn和Arber在研究细胞限制性和修饰现象时在大肠杆菌中发现了限制性内切酶，人们才搞清了细菌限制和修饰作用的分子机制。大肠杆菌K株和B株都含有各自不同的限制-修饰系统，它们均有三个连续的基因位点控制，其中hsdR编码限制性核酸内切酶，它能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断；hsdM的编码产物是DNA甲基化酶，催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应；而hsdS表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。lK和lB长期分别寄生在大肠杆菌的K株和B株中，宿主细胞内甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性内切酶的特异性降解，由于这种降解作用的不完全性，总有极少数入侵的DNA分子幸免于难，它们得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但丧失了在其原来宿主细胞中的存活力，因它们在接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。大肠杆菌C株不能产生限制性内切酶，因而其它来源的l噬菌体可以感染C株，而在C株中繁殖的l噬菌体则在K株和B株中受到严格的限制作用，细菌正是利用限制修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。二、限制性内切酶的类型 目前，在细菌中已发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类：I 型限制性内切酶、II 类限制性内切酶和III类限制性内切酶。其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA重组。I类和III类酶严格地说应该称为限制-修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。三、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）的性质和功能特点限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物细胞内，它们是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4 - 8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶（内切酶即在核酸分子链的内部制造切口的酶）。功能为自我保护作用。细菌的限制和修饰系统（R-M体系）：几乎所有的限制性内切酶都和能识别而且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共同作用，从而构成限制修饰系统（restriction-modification system）。R-M系统消化外来DNA，但自身的DNA因被甲基化受到保护。（1）限制（Restriction）：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（2）修饰（Modification）；细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。细菌细胞内有两种甲基化酶： Dam甲基化酶，在GATC腺嘌呤N6位置引入甲基； Dcm甲基化酶。在CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基.四、I和III类限制-修饰酶的基本特征 I型限制性内切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。I类限制-修饰酶的种类较少，研究较多的是大肠杆菌的EcoK和EcoB，它们均为异源多聚体，其亚基R、M和S分别具有限制性内切酶、甲基化酶和DNA特异性位点识别的活性。（1）识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列，非对称性。EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位点；在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。（3）作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 I类酶与其DNA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用，后者通过变构作用使酶处于活性状态。酶分子与识别位点结合之后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或限制、或修饰、或既不限制也不修饰。如果识别位点是全甲基化的，则ATP使酶-SAM复合物脱离DNA双链；如果识别位点是半甲基化的（即只有一条链甲基化），则酶-SAM复合物在ATP的帮助下使非甲基化的DNA链甲基化，同时SAM转变为相应的S-腺苷高半胱氨酸（SAH）；如果识别位点没有甲基化，ATP可使酶分子再次变构，暴露出限制性内切酶的活性部位，先释放SAM，然后以一种未知的机制在切割位点处将双链DNA切断，同时消耗ATP。I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端是单链形式。 III类限制-修饰酶由R亚基和MS亚基组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP，在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体仍为SAM。切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同的III类酶具有各自不同的距离，从7至26bp不等，如MboII识别5AAGA3序列，其切割位点则是：5-GAAGANNNNNNNNN-33-CTTCTNNNNNNNNN-5产生仅一个碱基突出的3末端。五、II类限制性核酸内切酶的基本特征 II类限制性核酸内切酶是H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。分离的第一个酶是Hind。该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双链DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组及分子生物学实验中被广泛使用。 1II类限制性核酸内切酶的命名 目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的约有100种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成，具体规则是：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还需用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子。酶名称的最后部分为罗马数字，表示在该生物体中发现此酶的先后次序，如HindIII则是在Haemophilus influenzae d株中发现的第三个酶，而EcoRI则表示其基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。 2II类限制性核酸内切酶的识别序列 多数II类酶的识别序列为四、五或六个碱基对，而且具有180旋转对称的回文结构。例如，EcoRI的识别序列为：5-GAATTC-33-CTTAAG-5对称轴位于第三和第四位碱基之间，对于由五对碱基组成的识别序列而言，其对称轴为中间的一对碱基。一部分II类酶的识别序列中某一或某两位碱基并非严格专一，但都在两种碱基中具有可替代性，这种不专一性并不影响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了DNA分子上的酶识别与作用频率。 按照概率计算，四、五或六碱基对的识别序列在DNA上出现的频率分别为1/256（4-4）、1/1,026（4-5）和1/4,096（4-6），若以100种不同的识别序列计算（四、五或六碱基对序列的酶各为20、30和50种），则DNA链上出现一个II类酶识别位点的概率为1/9，即任何一个DNA分子上平均每九对碱基中就会出现一个II类酶切口。实际上，由于不同生物的DNA碱基含量不同，因此酶识别位点的分布及频率也不同。大肠杆菌基因组中含有绝对优势的A和T，所以那些富含AT的识别序列（如DraI，TTTAAA；SspI，AATATT）较为频繁地出现，而链霉菌基因组因其GC含量高达70-80%，故富含GC碱基对的识别序列（如SmaI，CCCGGG；SstII，CCGCGG）较为常见。 3II类限制性核酸内切酶的切割方式 绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶（Isocandamers）。还有极少数酶的DNA切割活性依赖于识别序列内部碱基的甲基化作用。 根据被切开的DNA末端性质的不同（不考虑碱基序列），所有的II类酶又可分为5突出末端酶、3突出末端酶以及平头末端酶三大类。除后者外，任何一种II酶产生的两个突出末端在足够低的温度下均可退火互补，因此这种末端称为粘性末端（Cohesive Ends），这是DNA分子重组的基础。粘性末端（sticky ends，cohensive ends）：含有1至几个核苷酸的单链突出末端。分两种类型：5端凸出（如EcoR I切点）和3端凸出（如Pst I切点）。粘性末端的意义：连接便利。不同的DNA双链只要粘性末端碱基互补就可以连接；同一个DNA分子内通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。5末端标记。凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记；凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 补平成平齐末端。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。六、甲基化酶的基本特征 许多II类限制性核酸内切酶都有相应的甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。这类甲基化酶的命名常在相对应的限制性内切酶名字前面冠以M，例如，EcoRI的甲基化酶M.EcoRI催化SAM上的甲基基团转移到EcoRI识别序列中的第三位腺嘌呤上，经过M.EcoRI处理的DNA分子便不再为EcoRI所降解。有时一种甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口，如两个串联的TaqI识别位点经M.TaqI甲基化封闭后，出现了一个依赖于甲基化的限制性核酸内切酶DpnI的切割位点。 大肠杆菌细胞内存在着两种DNA甲基化酶，即DNA腺嘌呤甲基化酶Dam（DNA adenine methylase）和DNA胞嘧啶甲基化酶Dcm（DNA cytosine methylase），这两类酶本身没有限制性内切酶活性。Dam酶可在5GATC3序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基基团，而Dcm酶则在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5位置上甲基化，使得从大肠杆菌细胞中提取的DNA（包括染色体DNA和质粒DNA）不能被某些限制性内切酶切开，对上述两种甲基化酶的修饰作用敏感的限制性内切酶列在表3-8中。值得注意的是，有些限制性内切酶的识别序列本身不含有完整的Dam或Dcm甲基化酶识别序列，但在其左右两侧的核苷酸也许构成了完整的甲基化酶识别序列，如ClaI的识别序列为5ATCGAT3，当其5端外侧含有G、或3端外侧含有C、或两者同时出现时，便成为Dam甲基化酶的修饰靶子，而真正的甲基化位点却在ClaI的识别位点内。Dam酶的这种甲基化修饰作用反而增加了ClaI酶的切割位点特异性，其有效的识别切割序列不再是5NATCGATN3，而是5(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)3。另一方面，有些限制性内切酶的活性对Dam和Dcm的甲基化修饰并不敏感，例如BamHI、BglII、Sau3AI、PvuII、BclI和MboI等酶的识别位点均含有5GATC3序列，但前四个酶的DNA切割活性并不为腺嘌呤的甲基化作用所限制，这可能与限制性内切酶本身的空间结构以及DNA切割的机制不同有关。第二节 DNA 连接酶DNA连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段相邻的3-羟基端和5-磷酸基端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来。DNA连接酶广泛存在于各种生物体内。一、DNA ligase的特点基因工程常用的两种DNA连接酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶（T4-DNA Ligase）。大肠杆菌的DNA连接酶在催化连接反应时，需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为辅助因子，NAD+与酶形成酶-AMP复合物，同时释放出烟酰胺单核苷酸NMN。活化后的酶复合物结合在DNA的缺口处，修复磷酸二酯键，并释放AMP。此外，它只能连接粘性末端，最适反应温度30，为提高连接效率，控制温度在4-15 ，反应时间2h甚至过夜。T4噬菌体的DNA连接酶则以ATP作为辅助因子，它在与酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。T4-DNA连接酶由T4噬菌体基因编码，分子量约为60KD。目前商品化的T4-DNA连接酶均由大肠杆菌基因工程菌生产，这种工程菌的染色体DNA中整合了一个含有噬菌体DNA连接酶基因的l-DNA片段。当培养温度上升至42时，处于溶源状态的重组大肠杆菌大量合成T4-DNA连接酶，从而大大简化了纯化过程。它不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。最适温度37 ，控制温度在4-15 ，连接2h或过夜。双链DNA平末端之间的连接可在较高的温度下进行，如22 或30 。T4-DNA连接酶与大肠杆菌连接酶相比具有更广泛的底物适应性，它包括：（1）修复双链DNA上的单链缺口（与大肠杆菌DNA连接酶相同），这是两种DNA连接酶的基本活性；（2）连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，后者反应速度较慢；（3）连接完全断开的两个平头双链DNA分子，由于这个反应属于分子间连接，反应速度的提高依赖于两个DNA分子与酶分子三者的随机碰撞，因此在正常连接反应条件下速度缓慢，但若在反应系统中加入适量的一价阳离子（如150-200mM的NaCl）和低浓度的PEG，或者适当提高酶量及底物浓度均可明显改善平头DNA分子的连接。二、影响连接反应的因素1. 插入片段与载体分子的摩尔比值以2-3：1的比例最为合适。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。2. 连接片段自连待连接的两种DNA片段在DNA聚合酶的催化下，部分片段会自行连接环化，或连接成多聚体，影响连接效率。为避免这种现象发生，在连接之前，必须使其中一种DNA片段的5磷酸基转变为5羟基。此反应是在碱性磷酸酶的作用下完成的，称为脱磷酸化作用（dephosphoeylation）。3、连接反应的温度连接酶反应的最佳温度是37C。但在37下粘性末端之间的氢键结合很不稳定。所以一般采用 4-15 C。当粘性末端中G+C含量高时，可以提高反应温度。4、连接反应的时间连接反应温度在12-30之间时，连接时间约为1-16h。若连接温度更低，应适当延长连接反应的时间至24-48h.5、连接酶的用量在平末端连接反应中，最适的反应酶量约为1-2U；而对于粘性末端间的连接，在同样条件下，酶浓度仅为0.1U，便能达到最佳连接效率。不同的厂家规定的连接酶的活性定义单位不同，连接酶的活性可能相差几十甚至几百倍。在实际应用中，要参照厂家说明书确定使用酶量。 第三节 DNA聚合酶以自身为模板，以脱氧核苷酸为底物催化合成新的的酶称为聚合酶。在微生物、植物和动物中都发现有这种酶，而且原核细胞和真核细胞所含的聚合酶不只是一种。大肠杆菌中存在三种，分别称为聚合酶、和；真核细胞中也分离出四种，分别称聚合酶、和线粒体聚合酶。目前常用于基因工程的为大肠杆菌聚合酶和4聚合酶。后者由4噬菌体感染大肠杆菌所得。而用于扩增技术的多为耐热的Taq DNA 聚合酶，它是来自一种水生嗜热杆菌。一、基因工程中常用的DNA聚合酶1大肠杆菌DNA聚合酶 2Klenow 大片段酶3T7 DNA聚合酶 4T4 DNA聚合酶 5Taq DNA聚合酶 6 逆转录酶二、常用的DNA聚合酶的特点1. 共同特点：把dNTP连续地加到dsDNA分子的3-羟基端，催化DNA分子聚合，而引物不从DNA模板上解离。2. 主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。三、DNA聚合酶及其应用（一）大肠杆菌DNA聚合酶 I主要用于DNA切口平移中标记DNA探针。1大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质一条单链多肽，约1000个氨基酸残基。具5-3聚合酶活性、 5-3外切酶活性和3- 5外切酶活性三种酶活性 。 用枯草杆菌蛋白酶处理可以产生两个片段：一个N端小片段带有53外切酶活性，另一个大片段保留另两种活性，这个大片段称为Klenow大片段酶。（二）Klenow fragment（Klenow 酶）该酶实际上是大肠杆菌DNA聚合酶I N端的大片段，首先由Klenow通过枯草杆菌蛋白酶位点特异性降解的方法从DNA聚合酶I中制备的，故得此名。目前以将DNA聚合酶基因内的相应编码序列克隆表达，并由重组大肠杆菌廉价生产。大肠杆菌DNA聚合酶I在其单一多肽链上具有如下活性：（1）53的DNA聚合活性，使DNA链在模板的指导下延伸；（2）35的核酸酶外切活性，其主要功能是识别并切除错配的碱基，通过这种校正作用保证DNA复制的准确性；（3）53的核酸酶外切活性，这一功能具有三个特征，首先，待切除的核酸分子必须具有5端游离的磷酸基团，其次，核苷酸在被切除之前必须是已经配对的，最后，被切除的核苷酸既可以是脱氧的也可以为非脱氧的；（4）核酸内切酶活性，当一段DNA带有游离5端磷酸基团的不配对单链时，该酶可作用在与此单链相连的两对配对碱基之间，切断其磷酸二酯键。上述四种活性的催化中心在酶分子的多肽链上呈线型分布，作为该酶N端大片段的Klenow酶保留了大肠杆菌DNA聚合酶I 53的聚合活性和35的外切校正功能，删除了相应的53的外切活性及核酸内切酶活性。Klenow酶在分子克隆中的主要用途是：（1）修复由限制性核酸内切酶造成的3凹端，使之成为平头末端；（2）以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记；（3）用于催化cDNA第二链的合成；（4）用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。（三）T4 DNA聚合酶T4 DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化来的。由噬菌体基因43编码，为单链多肽酶。该酶不仅具有53的DNA聚合活性和53的核酸外切活性，而且具有极强的35核酸外切活性，后者对单链DNA的作用远大于双链DNA。主要用途有两个： 补平隐蔽末端：53合成DNA与35降解DNA是一对方向相反的可逆反应，在高浓度的dNTP存在时，模板中双链区的降解和合成反应趋于平衡，从而生成平头DNA分子，它可用于修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3突出末端。 DNA 3末端标记：用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。（四）T7 DNA聚合酶1来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基，有53聚合酶和35外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性。2T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强，一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 35外切酶活性高，单链和双链都能降解。 不受DNA二级结构的影响。其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍3T7 DNA聚合酶的用途 以大分子量DNA为模板的合成 进行末端标记。取代合成法标记3末端，这与T4 DNA聚合酶相同。 补平隐蔽末端。合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。（五）修饰后的T7 DNA聚合酶T7DNA聚合酶的化学修饰是去除了其35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。修饰后的T7 DNA聚合酶的用途：双脱氧法DNA测序； 标记DNA 3隐蔽末端； 更有效地补平末端。（六）逆转录酶（Reverse transcriptase）逆转录酶即依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。是Temin等于是1970年在致病RNA病毒中发现的。该酶以RNA为模板合成DNA。后来发现，反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。1来源RNA肿瘤病毒。最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）的逆转录酶及来源于莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus, M-MLV)的反转录酶。2AMV的性质由a和b两条多肽链组成。 a链有反转录活性和 RNaseH活性。RNaseH是a链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。 b链具有以RNA-DNA杂交双链分子为底物的53DNA外切酶活性。3逆转录酶的用途 合成cDNA，构建cDNA文库。以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。 RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。 制备DNA探针在随机引物（random primer）或oligo dT引导下，以poly(A)mRNA为模板，以-32P标记的dNTP为原料，可反转录合成放射性标记的cDNA链。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（七）真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶有与原核生物的同样的聚合酶活性，但多数没有3-5或5-3外切酶活性。主要有三种：DNA聚合酶，和， DNA聚合酶有4或5个亚基组成，主要负责染色体DNA的复制； DNA聚合酶为单链多肽，主要作用是修复核内DNA； DNA聚合酶存在于线粒体内，负责线粒体DNA的复制。最近从兔的骨髓细胞质中分离出了DNA聚合酶，它有3-5核酸外切酶活性，与原核生物的聚合酶相似。第四节 DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）1. TdT的生物学功能该酶来源于小牛胸腺，它是一种不需要模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为带有3游离羟基的双链DNA分子。当底物为3端突出的双链DNA时，TdT在Mg2+的存在下，即可将脱氧核苷酸随机聚合在两条链的3端。2. 末端转移酶的应用（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。（2）再生酶切位点（3）非放射性标记DNA片断的3端催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。（生物素-11-dUTP等）二、T4多核苷酸激酶（T4-PNP） 该酶从T4噬菌体感染的大肠杆菌中制备，它催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5末端上，其中包括两种反应：（1）磷酸激酶的正向反应，将ATP的g-磷酸基团转移到单链或双链DNA或RNA的5端游离羟基上，其催化5突出末端的磷酸化速度比平头末端和5凹端快得多，然而只要在反应体系重有足够量的酶和ATP存在，后两种末端也能得到完全磷酸化；（2）磷酸激酶的交换反应，在过量的ATP存在下，T4-PNP可将单链DNA或RNA5端的磷酸基团转移到ADP上，形成ATP，同时从g-32PATP中获得其放射性的g-磷酸基团使单链DNA或RNA的5端重新磷酸化，这个反应常用于核酸杂交探针分子的同位素标记。多核苷酸激酶的用途：DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。三、碱性磷酸酶/碱性磷酸单酯酶 该酶来源于大肠杆菌和牛小肠。细菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）和牛小肠的碱性磷酸单酯酶（CIP）均能催化DNA、RNA、核苷酸的5端除磷反应，因此在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5末端除磷操作，以提高重组效率；而用于外源DNA片段的5端除磷，则可有效防止外源DNA片段之间的连接。细菌碱性磷酸酶具有抗热性。小牛肠碱性磷酸酶在SDS中加热68oC可完全失活。第五节 核酸外切酶（ Exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。