第九讲---维生素类药.ppt

第九章维生素类药物的分析,主讲：马宁,目的与要求,掌握维生素A、B1、C、D、E的结构特点与化学性质；掌握维生素A、B1、C、D、E鉴别反应；掌握维生素A含量测定中紫外分光光度法测定原理与方法；维生素B1含量测定中非水溶液滴定法和硫色素荧光法的特点；维生素C含量测定中碘量法,2，6二氯靛酚法等方法的特点；熟悉维生素D及维生素E的含量测定方法。熟悉特殊杂质的检查。,概述,一、概念维生素1）维持人体正常代谢功能所必需的一类微量的生物活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节。2）大多数人体内不能自行合成,必须从食物中摄取。,二、化学结构：醇、酯、酸、胺、醛，酚三、分类脂溶性维生素:VitA、D2、D3、E、K1水溶性维生素:VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺,SECTION1CONSIDERATIONS,Vitaminsarenon-sugar,non-fatty,non-proteinsubstances,buttheyareessentialfornormalmetabolicfunctionofbody.Somevitaminscannotbesynthetizedbymammalian(哺乳的)speciesthemselves,onlybeabsorbedandstoredintact(完整的)vitaminsandprovitamins(维他命源)ofplantorigininfoodsthatareconsumed,andthenconvertenzymatically(酶)tovitaminsintheintestinalwall.,water-solublevitaminandfat-solublevitaminfat-solublevitaminvitaminA,D,E,Kwater-solublevitaminvitaminBgroup(suchasB1,B2),nicotinicacid,pantothenicacid(泛酸),folicacid(叶酸),ascorbicacid,Classification:,Inthischapter,weonlydiscussVitaminA,E,B1,andC(ascorbicacid),briftheothers,suchas:VitaminDgroupsterolSbCl3colorimetryVitaminK12-methyl-1,4-naphthaquinone(萘醌)Cericsulfatetitration(afterreduced)orUV-spectrophotographyVitaminB2stemnucleus,isoalloxazine(异咯嗪)ringUV-spectrophotographyNicotinicacid-COOHacid-basetitration,Analyticalmethod:,第一节维生素A（VitaminA）的分析,维生素A1活性最高，维生素A2的生物活性是维生素A1的30-40%，维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%，故通常所说的维生素A系指维生素A1。,第一节维生素A（VitaminA）的分析,1、来源1）天然产物主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油,即鱼肝油。从鱼肝油提取的VA多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。,2）人工合成产物全反式维生素A醋酸酯中国药典收载的VA是人工合成的VA醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液，其制剂有VAD胶丸和VAD滴丸。,2、药典收载情况,一、结构和性质（一）结构,H维生素A醇,-COCH3维生素A醋酸酯,-COC15H31维生素A棕榈酸酯,维生素A325.5100%新维生素Aa32875%新维生素Ab320.524%新维生素Ac310.515%异维生素Aa32321%异维生素Ab32424%,相对生物效价,1、具有UV吸收2、存在多种立体异构化合物,环己烯,共轭多烯侧链,存在多种立体异构化合物具有UV吸收易发生脱氢、脱水、聚合反应,1、具有UV吸收,2、存在多种立体异构化合物,（二）性质,3、易发生脱氢、脱水、聚合反应,4、与三氯化锑发生呈色反应,5、溶解性：脂溶性,VitA2,VitA3,3、易发生脱氢、脱水、聚合反应,去氢维生素A,去水维生素A,O2,H+重排,O,O,VA酸,VA醛,呋喃型氧化物（无生物活性）,H+,+,+,-H,去水VA（VA3）,丙烯型醇遇酸易发生脱水反应,环氧化物,VitA醛,VitA酸,CHCl3,不溶于水易溶于有机溶剂和植物油等,二、鉴别反应,CHCl3,反应机理：VA与三氯化锑(SbCl3)中存在的亲电试剂氯化高锑（SbCl5）作用形成不稳定的蓝色正碳离子。,注意事项：反应需在无水、无醇条件下进行。,水可使SbCl3水解成SbOCl,乙醇可与正碳离子作用，使正电荷消失,溶剂：饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液,2、紫外吸收特征,去水维生素A（A3）：6个共轭双键，其最大吸收波长向红移，在340390nm波长间出现3个最大吸收峰(348、367、389nm)。,维生素A：5个共轭双键，其无水乙醇液在326nm波长处有最大吸收。,去水维生素A,维生素A在盐酸催化下脱水生物VA3,3、薄层色谱法,BPUSP薄层板：硅胶G硅胶展开剂：环已烷-乙醚（8：2）显色剂：三氯化锑磷钼酸现象：蓝色斑点蓝绿色斑点,三、含量测定,（一）紫外-可见分光光度法,利用维生素A醇和其醋酸酯分子中具多烯共轭体系结构，在325328nm处有选择性吸收峰，故可进行含量测定。,维生素A醋酸酯的环已烷溶液在328nm处有最大吸收，吸收系数：1530；维生素A醇的异丙醇溶液在325nm处有最大吸收，吸收系数：1820；由于维生素A中稀释用油与有关杂质也有吸收，干扰测定，所以采用三点校正法测定含量。,立体异构体氧化产物及光照产物合成中间体去氢维生素A（VitA2）去水维生素A（VitA3）,三点校正法三波长测定法,1、原理：本法是在三个波长处分别测定吸收度根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量，故本法亦称“三点校正法”。,2、条件（1）杂质的吸收在310-340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。,1VitA的max（328nm）2和3在1的两侧各选一点,3、波长选择,第一法：等波长差法：1-2=3-1,直接测定法：VA醋酸酯（纯度较高）,第一法,4、测定方法,eg:中国药典中测定VA醋酸酯，1=328nm、2=316nm、3=340nm,规定值差值,1、max在326-329nm之间，且分别计算5个波长处的差值均不超过0.02，直接用测得的A328，用下述公式计算含量。,标示量%=A328D1900w/(W100L标示量)100%,纯度较高,2、最大吸收波长是否在326-329之间,计算吸收度比值之差是否超过0.02,第二法（皂化）,计算A328（校正）,A328,皂化,A328（校正）,A328,皂化,计算A值(一个或几个超过0.02),VitA胶丸的含量计算,？,5、生物效价及换算因数,1IU的VitA=0.300ug的全反式维生素A醇=0.344ug的全反式维生素A醋酸酯,（1）生物效价的定义,维生素A含量是用生物效价表示单位IU/g（国际单位）,生物效价（IU/g）=吸收系数换算因数,（2）换算因数的计算,1g维生素A醋酸酯相当的维生素A的国际单位数为,1g维生素醇相当的维生素A的国际单位数为,(VitA酯),(VitA醇),换算因子=IU/g/,1、判断法选择AA测定或A校正,2、求,3、计算效价,（3）计算,第二法（皂化法）：适用于维生素A醇不能用第一法测定的样品，用第二法测定。维生素A酯用醇制氢氧化钾加热皂化（水解），用乙醚提取，挥干溶剂，残渣用异丙醇溶解，测定含量。,测定对象：VitA醇,等吸收比法300、310、325、334nm,最大吸收波长是否在323-327之间,A300/A325是否超过0.73,色谱法纯化,计算A325（校正），或A值,计算A值,（1）基本步骤:第一步A选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已基本消除。,总结测定法,注意：C为混合样品的浓度,第二步求,第三步求效价,换算因数由纯品计算而得：,第四步：求标示量,示例：VitAD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物0.1287g至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A3000.374A316：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228,A300/A328：0.555A316/A328：0.907A328/A328：1.000A340/A328：0.811A360/A328：0.299,求本品中维生素A的含量？,A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.344,0.5550.9071.0000.8110.299,+0.010.010+0.02+0.04,=,以A328（校正）计算含量,三氯化锑比色法,（二）,优点简便快速,max618nm620nm,标准曲线法,思考题,1）三点校正紫外分光光度法测定维生素A含量的依据（原理）是什么？2）三点校正紫外分光光度法测定维生素A醋酸酯含量时，校正公式是什么？换算因子是多少？写出测定其胶丸含量时标示量%的计算式。,HPLC,维生素B12为水溶性维生素，过量可直接通过尿液排出体外；注射过量的维生素B12可出现哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能相发神经兴奋、心前区痛和心悸。,第二节维生素B1的分析,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱),（一）结构,一、结构与性质,还原性,1、溶解性易溶于水；微溶于乙醇；不溶于乙醚,2、硫色素反应,（二）性质,3、紫外吸收特性4、与生物碱沉淀试剂反应5、氯化物特性,1溶解性：易溶于水，水溶液呈酸性2硫色素反应：噻唑环在碱性介质中开环，在与嘧啶环环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素。,（二）性质,3盐酸液的246nm波长处测定吸收度，吸收系数为421。UV共轭双键max=246nm4碱性嘧啶环伯氨噻唑环季铵1、可与酸成盐2、与生物碱沉淀剂沉淀。3、含量测定非水碱量法,三、鉴别试验,1、硫色素反应,2、生物碱沉淀反应,3、与硝酸铅的反应,4、氯化物反应,VitB1+NaOH,共热,Na2S,Na2S+Pb(NO3)2,PbS2（黑色）,方法取本品约5mg，加氢氧化钠与正丁醇2.5ml，强烈振摇。放置分层，上面醇层显强烈兰色荧光。加酸消失，再加碱又重现。专属性反应。,1、硫色素反应（鉴别与含量测定）,硫色素反应为VitB1的专属反应,NaOH,环合,环合,2H,硫色素,VitB1,H+,H+,H+,H+,2、沉淀反应,S元素反应,Cl-反应,（一）非水溶液滴定法（原料药）,三、含量测定,原理,利用噻唑环上季铵和嘧啶环上氨基的弱碱性，在非水溶液中用高氯酸液滴定。,喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）,（二）紫外吸收（鉴别与含量测定）,VitB1分子结构中具共轭双键，在紫外区246nm处有最大吸收，可进行鉴别与含量测定。,原理,差示分光光度法,？,UV法,计算公式：,维生素B1片的测定，取20片称定。严细。称取细粉适量，相当于25mg，置100ml量瓶中，取5ml，在定溶于100ml，246nm测。标准吸光系数421。注意所使用的溶剂。,（二）紫外可见分光光度法（维生素1片剂）,片剂,=421,（每片）相当于标示量的%=,A=ECL,规格g/片,g/100ml,ChP,维生素B1注射液的测定取本品相当于B150mg，置200ml量瓶中，加水置刻度，取5ml，用盐酸定溶于100ml，246nm测，吸光系数421。,注射剂（每ml）相当于标示量的%=,规格g/ml,ml,NaOH,激发波长365nm发射波长435nm,制备氧化试剂、对照品溶液、供试品溶液测定方法：取40ml具塞试管3支或3支以上，各精密加入对照品溶液5ml，于其中2支（或2支以上)试管中迅速（12s）内加入氧化剂各3.0ml，在30s内加入异丁醇20.0ml，闭塞，剧烈振摇90s。于另一支试管中加3.5mol/l氢氧化钠溶液3.0ml以替代氧化剂，并照上述方法操作，作为空白。另取3支或3支以上的相同试管，各精密加入供试品溶液5ml，照上述对照品溶液管的方法，同法处理。于上述6支或6支以上试管中，各加入无水乙醇2ml，旋摇数s，待分层后，取上层澄清的异丁醇液约10ml，测定荧光强度。,（三）硫色素荧光法,激发波长365nm发射波长435nm,2、方法与计算,对照液,+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇,+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇,供试液,S,d,A,b,5ml供试品溶液中维生素B1的ug数,硫色素反应为维生素B1所特有的反应，专属性强，虽非定量完成，但控制好一定的条件可用于定量测定。注意（1）氧化剂需新鲜配制，并在4h内使用；（2）贮备液需避光冷藏，并在1个月内使用；（3）注意操作的平行性。,2、特点,灵敏度高，线性范围宽代谢产物不干扰，适用于体液分析,（三）高效液相色谱法,（四）毛细管电泳法,L（+）抗坏血酸（活性最高）D（-）异抗坏血酸（为前者5%）L（+）异抗坏血酸（无活性）D（-）抗坏血酸（无活性）,第三节维生素C的分析,一、结构与性质,(一）结构,3、两个手性碳原子，有四个光学异构体,1、二烯醇强还原性,2、弱酸性（一元酸）,4、紫外吸收,（二）性质,1、性状白色结晶或结晶性粉末；无臭，味酸；久置色渐变微黄，水溶液显酸性。,2、溶解性易溶于水；略溶于乙醇；不溶于氯仿和乙醚。,3、旋光性比旋度+20.50-+21.50,4、酸性,烯二醇结构,由于共轭效应的影响C3OHpKa=4.17C2OHpKa=11.5,故VC表现为一元酸，可与NaHCO3生成钠盐,、水解性,aOH,a2CO3,酮酸盐,6、强还原性,二烯醇结构,（）,抗坏血酸（有生物活性）,去氢抗坏血酸（有生物活性）,二酮古洛糖酸（无生物活性）,二酮基结构,50,7、具糖的性质,结构与糖类相似,8、紫外吸收特性,二、鉴别试验,1、氧化反应,（）与AgNO3反应,（）与2，6-二氯靛酚反应,（玫瑰色）,（无色）,（3）与碱性酒石酸铜反应,（4）与KMnO4反应,2、糖类的反应,3、紫外分光光度法243nm,2、糖类的反应USP,或盐酸,50,吡咯,（蓝色）,(糠醛),戊糖,3、UV,0.01mol/LHCl,三、杂质检查,（一）溶液颜色与澄清度检查Ch.P采用控制吸光度的方法控制有色杂质的量。1、原料取供试品3.0g，加水15ml，振摇使溶解，溶液应澄清无色；如显色，将溶液经4号垂熔玻璃漏斗滤过，照紫外可见分光光度法，在420nm的波长处测定吸光度，不得过0.03。2、片剂：，在440nm的波长处测定吸光度，不得过0.07。3、注射剂：，在420nm的波长处测定吸光度，不得超过0.06。,（二）铁和铜的检查,原子吸收光谱法,合格ba-b,指示剂淀粉指示液,（一）碘量法1原理,四、含量测定,（一）碘量法,取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。,2、测定方法,1、酸性环境减慢VitC被O2氧化速度,2、新沸冷H2O减免水中O2的干扰,3、立即滴定减少O2的干扰,4、制剂测定时注意，注意消除辅料的干扰。,Na2S2O5+H2O,2NaHSO3,NaHSO3+CH3COCH3,3、讨论,USP,JP,（2）快速滴定2min内,（1）酸性环境HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,（3）剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,（4）缺点,需经常标定,贮存一周,干扰多氧化力较强,（四）高效液相色谱法,（三）紫外-可见分光光度法,第四节维生素D的分析,维生素D2结构式,一、结构与性质,1、结构,9，10开环的骨化醇（calciferol）或麦角骨化醇（ergocalciferol）,9，10开环的胆骨化醇（colecalciferol）,第四节维生素D的分析,2、性质1、性状无色针状结晶或白色结晶粉末；无臭、无味：遇光或空气均易变质。2、溶解性在氯仿中极易溶解，在植物油中略溶，在水中不溶。,3、不稳定性含多个烯键，性质不稳定，遇光或空气及其它氧化剂无发生氧化变质，使效价降低，毒性增强。4、旋光性VD2：6个手性碳，VD3：5个手性碳二者均具有旋光性。5、显色反应：甾醇类共有反应6、紫外吸收特性,二、鉴别反应,1,2,3,4,显色反应1.与醋酐-浓硫酸反应2.与氯化锑反应3.其它,比旋度测定,其它HPLC,TLCm.p.,UV,IR,维生素D2维生素D3的区分反应,二、鉴别试验（一）显色反应1、与醋酐-浓硫酸反应。2、与三氯化锑反应橙色粉红色。,3、其他显色反应三氯化铁橙黄色二氯丙醇绿色+乙酰氯试剂绿色,（二）比旋度鉴别维生素D2在无水乙醇中比旋度为+102.5至+107.5，维生素D3为+105至+112。（注意应于容器开启后30min内取样，并在溶液配制后30min内测定。）（三）其他鉴别方法TLC、HPLC法、制备衍生物测定熔点，UV、IR,（四）维生素D2、D3的区分反应维生素D的96%乙醇溶液加乙醇和85%的硫酸，维生素D2显红色，在570nm有最大吸收；维生素D3显黄色，在495nm有最大吸收。,（一）麦角甾醇的检查利用其与洋地黄皂甙生成沉淀，检查浑浊。取10mg加90%乙醇2ml，加洋地黄皂甙溶液2ml（取洋地黄皂甙20mg加90%乙醇2ml，加热溶解制成）。混合，放18小时，不得浑浊和沉淀。（二）前维生素D的光照产物有光甾醇、速甾醇、5，6-反式维生素D。中国药典上未收载该项检查。,四、含量测定,HPLC根据样品中干扰物质存在的情况选择三种不同方法测定。讨论：1、采用以硅胶为填充剂，流动相为非极性溶剂正己烷正戊醇（997：3）的正相高效液相色谱法，检测波长254nm。2、避光，避免氧化。3、皂化提取过程复杂。4、内标可选用邻苯二甲酸二甲酯。,苯二氢吡喃,第五节维生素E的分析,一、结构与性质,（一）结构：苯并二氢吡喃醇衍生物,苯环+二氢吡喃环+饱和烃链,VitE(dl-TocopherylAcetate),*,*,*,生物效价右旋体：消旋体=1.4：10,（天然品）,（合成品）,chp规定维生素E（消旋-生育酚醋酸酯）,（二）性质,2、溶解性易溶于有机溶剂，不溶于水,3、紫外吸收特性284nm,1、性状微黄色至黄色或黄绿色澄清的粘稠液体;遇光色渐变深。,吸收系数41-45。,（二）性质,4、水解性酯键易水解（H+、OH-）,5、易氧化,对氧敏感，成-生育醌和-生育酚二聚体。,1、硝酸反应,二、鉴别试验,生育红（橙红色）,生育酚,HNO3,强氧化剂,取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75加热15分钟，溶液应显橙红色。,2、三氯化铁联吡啶反应,红色,（1）原理维生素E在碱性条件下，水解生成游离生育酚，经乙醚提取后，被三价铁氧化，二价铁与联吡啶生成红色配位离子。非专属性。,生育酚,对-生育醌,弱氧化剂,红色,（2）方法取本品10mg，加醇制氢氧化钠试液2ml，煮沸放冷，加水4ml，乙醚10ml，取乙醚层，加2，2-联吡啶乙醇液，几滴，三氯化铁乙醇液几滴，应显血红色。,=41.045.5,max=284nm,min=254nm,0.01%无水乙醇中,薄层板硅胶G,展开剂环己烷-乙醚（4：1）,显色剂硫酸（1055）,VitERf=0.7,5、气相色谱法,（一）酸度检查制备过程中引入的游离醋酸。取乙醇与乙醚各15ml，置锥形瓶中，加酚酞指示液0.5ml，滴加NaOH滴定液（0.1mol/L）至微显粉红色，加本品1.0g，溶解后，用NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定，不得过0.5ml。,（二）游离生育酚,利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈.,（二）游离生育酚,硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄灰紫）,试剂,2、,（M生育酚=430.8）,例,取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。,2.15,药典规定,消耗硫酸铈液（0.01mol/L）1.0ml,设：应消耗硫酸铈液Vml,0.011.0实际浓度V,若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量,例Ce(SO4)2=0.01020mol/L,四、含量测定,1、GC法,选择性好灵敏度高速度快分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制,特点,载气N2固定液硅酮（OV-17）担体硅藻土或高分子多孔小球柱温265检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标正三十二烷n500R2,内标法加校正因子,内标法,供试液（样品+内标）,内标物,对照液（对照+内标）,校正因子：,实际工作中的计算方法,内标液取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液