第九章-基因文库与克隆分析应用(新).ppt

第九章基因文库与克隆分析应用,一、复习二、目的基因的获得三、外源基因表达系统四、克隆分析应用,克隆（重组技术）的基本步骤:目的基因的获取：供体生物基因或称外源基因的获取与纯化载体的选择限制性酶切：目的基因与载体形成粘性末端纯化连接：目的基因连接到载体中转化：将这个重组DNA分子转入受体细胞筛选和鉴定：对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定基因表达：进行培养，检测外源基因表达产物,复习,复习,1、限制性内切酶的定义是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。,2、限制性内切酶的发现Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，为保证自身不被外来噬菌体所感染，其DNA被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制修饰。,限制性内切酶,质粒的生物学基本特性：自主复制性：携带有自己的复制起始区（ori），它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不相容性：不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞争，拷贝数多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中。稳定性：质粒在宿主细胞中保持着一定的考贝数。寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。表现型：不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等。,复习,（一）原核生物基因文库的构建（二）真核生物目的基因的获得,二、目的基因的获得,二、目的基因的获得,（一）原核生物基因文库的构建1、限制性酶切：对提取的总DNA酶解，产生出所有可能大小的片段。2、载体连接：电泳分离后的DNA片段与载体连接。3、转化：将带有外源DNA的载体导入宿主细胞。化学方法用10mMCaCl2在0条件下低渗处理使细胞肿胀，加入的DNA可以吸附在细胞的表面，42热激，DNA便被吸入细胞。,二、目的基因的获得,电穿孔法利用高压脉冲，在宿主细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA便可进入。,4、重组子的筛选与鉴定常用于筛选鉴定的方法有以下几种：a、抗生素抗性筛选b、抗性的插入失活,c、蓝-白斑筛选如pUC质粒含LacZ基因（编码半乳糖苷酶），该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，称之为蓝-白斑筛选。,二、目的基因的获得,二、目的基因的获得,蓝白斑平板,（二）真核生物目的基因的获得1、cDNA文库的构建：(1)分离提取细胞总RNA(2)mRNA与其他RNA的分离，mRNA仅占总RNA的12%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开(p-108)。(3)以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链mRNA纯化后，加入Oligo(dT)作为引物，引导DNA链的合成，同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-DNA杂合分子。,二、目的基因的获得,二、目的基因的获得,（4）用RNA酶解去掉RNA链，以DNA链为模板，反向合成DNA第二条链。用S1核酸酶打开发夹结构，并把双链DNA分子的两端切平。所得到的为cDNA。克隆进载体即构成cDNA文库。(p-109),1样品处理。组织：取50-100mg组织（新鲜或-70及液氮中保存的组织均可）置1.5mL离心管中，加入1mLTrizol充分匀浆，室温静置5min(p-108)。,二、目的基因的获得,RNA的提取,2加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置2min。34离心，12000g15min，取上清。4加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。54离心，12000g10min，弃上清。6加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4，7500g5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65促溶10-15min。,二、目的基因的获得,RNA的提取,2、cDNA的扣除文库将两种不同组织来源的mRNA进行比较，用扣除杂交（subtractivehybridization)排除相同部分（即共同表达的那部分mRNA），选出有差异的、特异表达mRNA，构建成的cDNA文库。扣除文库的构建过程从两种不同类型的细胞T、D分别提取mRNAT细胞mRNA逆转录合成单链的cDNA向T细胞cDNA中过量加入D细胞总mRNA两者有共同序列的mRNA和cDNA形成mRNA-cDNA杂合分子，余下单链cDNA代表了仅仅存在于T细胞表达的基因信息。羟基磷灰石层析柱（HAP)分离单、双链核酸分离得到的单链cDNA合成双链再构建成文库,二、目的基因的获得,二、目的基因的获得,3、对已知序列目的基因的筛选PCR法筛选：根据已知目的基因两端序列，分别合成20个bp的引物，经过大约30个循环扩增目的基因。(2)DNA探针筛选：构件的cDNA文库利用原位DNA探针筛选目的基因。(3)基因芯片法,PCR反应概述PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用,二、目的基因的获得,（1）PCR筛选法：,多聚酶链式反应概述（PCR：PolymeraseChainReaction）,20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能将目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,以便分析和操作。,（1）PCR筛选法：,PCR技术的创建,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1985年,美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,（1）PCR筛选法：,PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,PCR原理,与DNA的天然复制过程相似，PCR依赖于与靶序列两端互补的特异性寡核苷酸引物，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。,模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR原理,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应底物，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,PCR原理,PCR循环,PCR原理,PCR反应体系,总体积25-50-100lBuffer缓冲液dNTP底物Primer（2）引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶,PCR反应体系,（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L反应体系。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应体系,（2）引物浓度100pmol/100L反应体系浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,PCR反应体系,引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以20-40个碱基为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基，需与模板DNA严格配对；5端无严格限制,可引入酶切位点。,PCR反应体系,（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquatics)1.0U/100L反应体系酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。,PCR技术的特点,1、特异性,引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。,PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。,2、灵敏度高,PCR技术的特点,PCR技术的特点,3、简便、快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增仪进行变性-退火-延伸反应，一般在2小时左右完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。4、对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,（2）DNA杂交筛选1、DNA探针，是以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的一段已知的基因片段。应用这一基因片段即可与待测样品杂交。2、如果靶基因和探针的核苷酸序列相同或相似，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。3、以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测。,二、目的基因的获得,二、目的基因的获得,（3）基因芯片(genechip)又称DNA芯片、生物芯片。基因芯片的测序原理：杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。1、在一块基片表面固定了序列已知的寡聚核苷酸的探针。2、溶液中（文库中的核酸序列）带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配。3、通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。,二、目的基因的获得,基因芯片,二、目的基因的获得,芯片杂交,二、目的基因的获得,信号数据读取,二、目的基因的获得,（4）杂交扣留与释放（5）染色体步移从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠序列和染色体的其他序列。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移（ChromosomeWalking）,4、未知序列目的基因的筛选（1）从蛋白质寻找基因早期寻找基因的方法，对特异表达的蛋白质进行序列分析，并推测一段核苷酸序列，合成DNA探针，筛选分离相应的基因。,二、目的基因的获得,二、目的基因的获得,(2)表达筛选酵母双杂交（yeasttwo-hybridsystem）将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子的DNA结合结构域基因和激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。双杂交系统的建立得利于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain,简称为DB)和转录激活结构域(activationdomain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。,二、目的基因的获得,酵母双杂交,二、目的基因的获得,酵母双杂交,（3）同源性序列搜索在Genebank等网站中收录了大量DNA序列的数据，用同源性比较工具Blastn软件，搜索基因之间存在着的一些保守序列，可以判断某些新基因的存在。,二、目的基因的获得,三、外源基因表达系统,基因表达是指外源基因克隆到某种表达系统的载体中，再引入合适的宿主细胞中进行表达。常用的表达系统，大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳类细胞表达系统。,（一）大肠杆菌表达系统1、大肠杆菌表达的特点培养方法简单生长迅速成本低人类胰岛素基因生长激素基因人干扰素基因都是在大肠杆菌中得到表达。,2、外源基因在原核细胞中表达的调控元件外源基因在原核细胞中表达的强弱，关键因素取决于所用的启动子。强启动子起始合成mRNA的效率高，弱启动子合成的效率低。,三、外源基因表达系统,（1）大肠杆菌表达载体常用的启动子LacUV5启动子来源于大肠杆菌乳糖操纵子。不需要活化蛋白CAP和cAMP，只要有乳糖就能够启动转录。,三、外源基因表达系统,Trp启动子来源于大肠杆菌色氨酸操纵子，启动子的下游有3个SalI、BamHI、Smal酶切位点，可插入外源基因。,（2）核糖体结合位点核糖体结合位点（SD序列）对真核基因在细菌中高效表达是十分重要的。因为原核基因都有它特异性SD序列，因此真核基因在原核生物中表达，在载体上必须有该基因可用的SD序列。,SD序列是由Shine-Dalgarno1974年首先发现，它是由起始密码子AUG和一段位于AUG上游310bp处的39bp的序列组成。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16SrRNA3/末端的富含嘧啶的序列互补，mRNA于是可与核糖体很好结合。mRNA5/-AGGAGGU-AUGrRNA3/-UCCUCCA-SD序列影响翻译的效果主要取决于下列因素：mRNA的SD序列与16SrRNA3/末端的互补程度SD序列的核苷酸组成以及与AUG之间的距离310bpAUG两侧位于-20至+13之间的核苷酸组成mRNA5/端形成的二级结构会影响翻译效果,三、外源基因表达系统,3、真核基因在大肠杆菌中表达的形式融合蛋白的胞内表达非融合蛋白的胞内表达重组蛋白的分泌表达,三、外源基因表达系统,（二）酵母表达系统酵母具有真核细胞的特点，可以对蛋白进行多种翻译后修饰。培养比较容易。常用的啤酒酵母已被美国确定为安全的生物。具有分泌功能外源蛋白可以分泌到细胞外。,（三）昆虫细胞表达系统昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通过杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白。允许插入较大的外源基因。可以胞内表达，也可以进行分泌性表达。能进行蛋白质翻译后加工、糖基化和磷酸化。杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的。,三、外源基因表达系统,（四）哺乳类细胞表达系统表达载体通常是来自动物病毒，如SV40病毒和腺病毒等，经人工改造，加增强子、启动子等。哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长。,四、克隆分析应用,1、克隆分析（1）克隆的鉴定：对克隆进行部分或全序列的测定。序列分析可提供推测基因的大小、限制图谱以及方向或者可读框（ORF）。须有实验证明推测目