骨骼肌卫星细胞研究进展

骨骼肌卫星细胞的研究进展,目录,一、基本概念的介绍二、卫星细胞分离方法的比较三、卫星细胞纯化方法的比较四、卫星细胞的鉴定方法五、卫星细胞在畜禽上的研究进展,一、卫星细胞基本概念的介绍,卫星细胞：骨骼肌卫星细胞位于肌膜和基底膜之间，一般情况下这些细胞处于静止状态，当肌细胞受到损伤刺激或诱导时，卫星细胞才被激活、增殖，并与原有的骨骼肌细胞相互融合，形成新的肌纤维细胞。总结卫星细胞的功能，可以得出以下几个要点：1位于肌膜和基底膜之间，起源于中胚层干细胞,是一种肌源性干细胞；2一般情况下处于静止状态，当肌细胞受到损伤刺激或诱导时才被激活；3卫星细胞具有分化功能，在一定条件下可以向成心肌细胞、成脂细胞以及成骨细胞等方向分化。,刚分离的卫星细胞图片,贴壁后的卫星细胞,长满瓶底时的细胞形态,卫星细胞在组织中的分布,A,B,C,D,A,B,A、卫星细胞融合成肌管B、卫星细胞分化为成熟脂肪细胞,二、卫星细胞分离方法的比较,卫星细胞分离方法有两种：组织块法和酶消化法组织块法：将肌肉组织在无菌条件下剔除血管、脂肪、肌腱等组织，用眼科剪剪成1mm3的小块，然后培养在培养瓶中，3天左右卫星细胞就从组织块周围爬出，待细胞长满培养瓶的70%80%后就消化传代得到卫星细胞。酶消化法：酶消化法就是向组织块中加入适量的酶，在37恒温水浴锅中消化一段时间，然后加入含血清的培养基终止消化，最后进行分离培养。酶消化法所使用的酶主要有胶原蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶三种。,aP0.05,表1各种消化酶消化细胞所得的细胞数和存活率比较,链霉蛋白酶、胰酶和胶原酶消化猪骨骼肌对比实验结果如下表：,三、卫星细胞纯化方法的比较,卫星细胞纯化方法最常用的包括差速贴壁法、Percoll液梯度离心法。差速贴壁法：关键是利用成纤维细胞贴壁能力比卫星细胞强而先贴壁的原理来分离细胞。成纤维细胞的贴壁时间一般为3060min，因此在此时间段内转出上清液于一新培养瓶，重复3次即可完成细胞的纯化。Percoll液梯度离心法：先将离心管壁用牛血清湿润，除去多余血清，将600mLL-1和200mLL-1Percoll分离液各3mL缓慢加入离心管中，制成非连续密度梯度液，加入重悬后的细胞悬液3mL，1000rmin-1离25min，取交界面的细胞，即为卫星细胞。,两种纯化法的比较,由上表可以看出，两种纯化方法对卫星细胞的增殖无显著性差异。,表2单位面积内两组细胞增殖情况（n=10s）,注：同一时刻每两组之间比较均为P0.05。,表3两组卫星细胞融合率比较（）,从统计结果可以看出，梯度离心纯化法培养的卫星细胞融合率明显比差速贴壁法的细胞融合率要高，差异极显著（P0.01)，证明这种方法获得的细胞纯度更高。,注：与贴壁组比较，aP0.01.,A：Pax7在细胞核中呈阳性表达；B：应用DAPI对细胞核进行染色；C：A与B叠加图。,A,B,C,D,E,F,G,H,I,D：MyoD在细胞核中呈阳性表达；E：应用DAPI对细胞核进行染色；F：D与E叠加图片。,G：Desmin在细胞质中呈阳性表达；H：应用PI对细胞核进行染色；I：G与H叠加图片。,Pax7是静息期的特异性标志，MyoD和Desmin是增殖期的特异性标志。,四、卫星细胞的鉴定方法,1畜禽卫星细胞体外培养体系建立的研究进展,五、卫星细胞在畜禽上的研究进展,从卫星细胞第一次被发现至今，关于体外培养体系建立的研究已经取得了很大的进展，技术也很成熟，下面就简要介绍一下各物种在这方面的研究进展。,表4畜禽卫星细胞体外培养体系建立的研究进展,2骨骼肌卫星细胞增殖分化的研究进展,E.K.Sissom等（2006）研究美仑孕酮醋酸盐(MGA)或黄体酮(P4)对牛骨骼肌卫星细胞的影响。,KeitaroYAMANOUCHI等（2007）为了检验山羊骨骼肌细胞在体外具有向成肌细胞和成脂细胞分化的能力。,卫星细胞分化为肌管,卫星细胞分化为脂肪细胞,阮井玲等（2008）以体外培养的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料，利用RNAi技术，以Smad3为靶基因进行干扰研究，研究干扰前后猪骨骼肌卫星细胞增殖情况的变化。下图可以看出干扰后猪骨骼肌卫星细胞增殖速度与正常细胞相比较快（0.05）。X.Li等（2008）以鸡骨骼肌卫星细胞为对象也证明Smad3依赖的信号通路可能涉及到卫星细胞增值和分化的管理。,影响细胞增殖和分化的因素很多，如上文提到的外源添加的黄体酮可影响细胞增殖，同时也受基因的调控如Smad3等。卫星细胞在体外分化同样受到环境的控制，生长密度大或培养在含胰岛素、转铁蛋白的培养基中，细胞就会向成肌或成脂方向分化。,3在骨骼肌卫星细胞中开展功能基因的研究进展,ClaudiaKalbe等（2007）从蛋白质水平研究雌激素受体（ER和ER）是否在从半膜肌（SM）得到的卫星细胞中表达。,A利用老鼠ER-特异性单克隆抗体孵育细胞B苏木精染色细胞核,C利用兔ER-特异性多克隆抗体孵育细胞D苏木精染色细胞核,由图可以看出，对骨骼肌细胞核ER和ER进行免疫组织化学染色显示在来源于卫星细胞的成肌纤维上显阳性。,A,B,C,D,X.Li等（2009）以鸡卫星细胞为材料研究转化生长因子-1（TGF-1）对肌肉细胞的凋亡作用。,由左图可以看出，实验组细胞凋亡的数量显著高于对照组，说明TGF-1能诱导卫星细胞凋亡。,S.E.Ouellette等（2009）为了鉴定LEK1的功能，通过细胞转染技术抑制LEK1蛋白（LEK1(991)和LEK1(911)）评估细胞增殖情况。,由图可以看出，经转染以后，Ki67的表达量降低，说明LEK1起到协调肌原性细胞增殖的作用。,K.Tripathi等（2011）通过体外培养的成肌细胞，利用了实时荧光定量PCR检测了肌肉抑制素，卵泡抑素，核心蛋白聚糖和三种特殊的肌肉转录因子在成年山羊肌管中的mRNA表达水平。,这些试验结果为我们研究肌肉生长的调节提供了基本依据。,由以上几篇文章可以看出，在骨骼肌卫星细胞上进行的功能基因的研究主要是研究基因的表达水平和功能，为后续的深入研究（如基因功能调控）和生产实践（如调节生长发育）提供理论依据。,4利用骨骼肌卫星细胞进行肌纤维类型转换的研究进展,J.M.Gonzalez等（2007）为了研究雷托巴胺盐酸盐（RAC）和群勃龙醋酸酯（TBA）对背最长肌纤维横截面积（CSA）、直径和卫星细胞数的影响。,由表中数据显示TBA和RAC对型纤维的作用效果要明显。,黄金秀等（2010）研究不同浓度共轭亚油酸（conjugatedlinoleicacid，CLA）对体外培养的猪骨骼肌肌纤维类型组成的影响规律。以体外培养的原代猪骨骼肌卫星细胞为材料，在卫星细胞向肌纤维转化时添加不同水平CLA。分别采用相对定量RT-PCR测定肌纤维中MyHC、MyHC2a、MyHC2b、MyHC2x4种MyHC基因表达。,以体外培养的骨骼肌卫星细胞为材料对骨骼肌纤维类型进行研究，发现肌纤维的生长规律，为体外调控肌纤维生长，改善肉品质提供理论依据。,随着卫星细胞体外培养技术的成熟，以及研究趋势的变化，