02.组织培养细胞的生物学

组织培养细胞的生物学,第二章,2020/4/27,2,Contents,细胞生存环境和代谢,附着底物,人工培养基,教学内容,1,2,3,5,体内、外细胞的差异和分化,体外培养细胞的分型,细胞相互关系,细胞系（株）的建立,8,7,6,4,3,组织培养细胞的生长和增殖过程,2020/4/27,3,在个体发生过程中，细胞通过不断的生长和繁殖，数量增多，与此同时发生着分化。分化：及细胞在形态和功能上由一般发展到特殊的过程，由于分化的结果，形成了各种组织和器官。,一、体内、外细胞的差异和分化,2020/4/27,4,因模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异，易发生以下变化：分化现象减少，形态和功能趋于单一，生存一定时间后衰退死亡或发生转化，变成有无限生长能力的连续细胞系或恶性细胞系。如：腺细胞分泌机能丧失，肌细胞纤维细胞化。原因：细胞在人工培养以后，可能导致很多基因关闭，而导致分化停止、功能丧失。可以利用这一点，来研究基因表达和调控。,（一）差异,2020/4/27,5,体外培养细胞分化能力并未完全丧失，只是因环境改变其分化表现和原体内不同。如：体内：成纤维细胞、骨细胞胶原体外：成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞胶原。如何揭示细胞分化的条件，阐明分化调控的机制是主要的。,（二）分化,2020/4/27,6,据能否贴附在支持物上生长的性质，分：,2、悬浮型(ES细胞，老鼠，初生培养；荧光，DAPI染色剂),1、贴附型(心肌细胞，老鼠，初生培养),二、体外培养细胞的分型,2020/4/27,7,培养时能贴附在支持物上生长，大多数细胞呈贴附型生长。特点：1、分化现象变得不显著，易失去它们在体内时的原有特征。2、形态上常表现单一化的现象，并常反映其胚层起源，类似所谓“返祖”现象。如：起源于内、外胚层的细胞多呈上皮型。中胚层-呈成纤维细胞型。体外培养细胞的形态常表现有一般化的倾向。因此，判定细胞形态很难按体内细胞标准确定，仅大致分成以下几类：,（一）贴附型,2020/4/27,8,与体内成纤维细胞的形态相似而得名。心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮（中胚层间充质起源）都呈此形态。,成纤维细胞型,1、成纤维细胞型,2020/4/27,9,起源于内、外胚层细胞。如：皮肤表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。,上皮细胞型,2、上皮细胞型,2020/4/27,10,此型不稳定，有时难与其它细胞相区别。,游走细胞型,3、游走细胞型,2020/4/27,11,除上述三型外，其它难以确定它们规律和形态的，统归为“多形细胞型”。如：神经组织的细胞。,多型细胞型,4、多形细胞型,2020/4/27,12,培养细胞的形态受多种因素的影响，如：温度，二氧化碳，酸、碱、密度等。如：Hela细胞，本属上皮型，但过酸、过碱变成梭形。上皮细胞数量少时，呈星形或三角形。数量多时，呈上皮型。,它来源于美国的HelenLane，她1951年死于子宫颈癌,2020/4/27,13,培养时，不贴附与支持物上，而呈悬浮状态生长。如：某些癌细胞、白细胞。其优点：细胞生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢研究。,S180细胞,（二）悬浮型,2020/4/27,14,体外培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液。这一过程称“传代”。每次传代都要影响细胞生长过程。另外，体外生存期一般也不是无限的。（一）组织培养细胞生命期（二）组织培养细胞一代生长过程（三）细胞周期,三、组织培养细胞的生长和增殖过程,2020/4/27,15,培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，传3050代，相当150300个细胞周期，在全生存过程中大致经历以下三个阶段：1、第I期-原代培养期（初代培养期）从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，约14周。与体内细胞性状相似，适宜进行疫苗制备、药物测试、移植等。为保持二倍体体细胞性质，应在初代或传代后早期冰冻。,（一）组织培养细胞生命期,2020/4/27,16,2、第II期-传代期初代培养细胞一经传代后，便称做“细胞系”。此期，是生命期中持续时间最长、细胞增殖旺盛，呈二倍体核型的细胞系称“二倍体细胞系”3、第III期-衰退期细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞形态轮廓增强，最后衰退死亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在不明原因的影响，细胞可能发生自发转化。标志之一，是细胞获得不死性即持久性增殖能力，这样的细胞群体称“无限细胞系”。主要发生在II期，核型大多变成异倍体，转化后的细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性而无恶性。,（一）组织培养细胞生命期,2020/4/27,17,初代培养有限细胞系无限细胞系,接种培养,第一次传代,传代,传代间隔,老化,死亡,转化,指数细胞数量,02468101216周,2220181614121086,2020/4/27,18,所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与接种数量、细胞生物学性状以及营养液的性质等有关。细胞的“一代”仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。如：某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同。在细胞一代中，细胞能倍增36次,（二）组织培养细胞一代生长过程,2020/4/27,19,细胞传一代后，一般要经过以下几个阶段：1、游离期（悬浮期）2、贴壁期3、潜伏期4、指数生长期5、停止期,（二）组织培养细胞一代生长过程,来源：人体肾脏形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：该细胞含腺病毒5DNA,2020/4/27,20,1、游离期（悬浮期）细胞接种后，在培养液中呈悬浮状态的阶段，细胞胞质回缩，胞体变成圆形。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2020/4/27,21,2、贴壁期：细胞附着于支持物上。原代细胞：24h内贴壁。连续细胞系：530分钟贴壁。单个细胞快于细胞团、组织块。贴壁与许多因素有关：培养基的酸度、污染，胶塞和培养器皿的清洁度，细胞本身的活性等等。血清中有许多促使细胞贴壁的冷析球蛋白（CIG）和纤粘素（FN）CIG与多聚赖氨酸联用，有利于细胞迅速贴壁。贴壁后细胞变成放射延展细胞极性细胞再经过一个潜伏期阶段后，才进入生长期。,细胞的贴壁和延展,（二）组织培养细胞一代生长过程,2020/4/27,22,3、潜伏期：此时，细胞有生长活动，而无细胞分裂。原代细胞潜伏期：2496h或更长。连续细胞系、肿瘤细胞潜伏期短：仅624h。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，进入指数生长期。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2020/4/27,23,4、指数生长期（对数生长期）此时期，细胞增殖旺盛，细胞数成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。此阶段可用细胞群体倍增时间、细胞分裂指数（MI）等来判断。MI：细胞群中每1000个细胞中的分裂细0.20.5%，连续细胞系、肿瘤细胞的MI可高达35%。持续35天，细胞数量增多，最后生长面积消失，细胞相互接触连接成片。此时，细胞由于相互接触而发生“接触抑制”。表现为细胞扩展运动停止。保证细胞不重叠生长。肿瘤细胞无接触抑制特征，能相互重叠，向三维空间发展，只要原因充分，细胞仍能分裂、增多。正常细胞生长汇合成单层时，细胞达到一定密度，细胞停止分裂，这种现象称“密度抑制”。导致细胞停止分裂。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2020/4/27,24,5、停止期：数量已达饱和，停止增殖，但仍有代谢活动，营养枯竭，代谢产物积累，PH降低，细胞会中毒。通常，细胞长满瓶底80%时即传代，接种到23个新瓶中。,（二）组织培养细胞一代生长过程,2020/4/27,25,2020/4/27,26,是指细胞每一次增殖所经历的全过程。每经过一个增殖周期，数量就增加一倍。据细胞周期不同时期的生化特点，可划分为四个连续的时期：G1期（DNA合成前期）细胞间期S期（DNA合成期）主要是DNA的复制。G2期（DNA合成后期）M期（有丝分裂期）：完成染色体的分配。细胞完成一次细胞周期所需要的时间称为-“细胞周期时间”。,（三）细胞周期,2020/4/27,27,S期：DNA合成期间期：是细胞代谢、DNA复制旺盛时期。G1、G2：两个间隙有丝分裂：细胞核及其染色体分裂。细胞分裂期：胞质分裂：细胞质分裂成两个子细胞。,2020/4/27,28,有丝分裂过程,2020/4/27,29,细胞生长的速度与细胞周期时间有关。正常细胞和肿瘤细胞相比较，细胞周期时间大致相接近的。如：人的正常肠上皮细胞的细胞周期时间是：13天。人的结肠癌细胞的细胞周期时间是：2.5天。急性白细胞的细胞周期时间是24天。正常白细胞的细胞周期时间是1天。所不同的是：正常细胞的增殖达到一定限度就停止了，而且增殖的细胞基本上相当于丢失的细胞数，总数始终保持相对恒定。肿瘤细胞是以持续的无限制增殖、永不停止。一般说来，哺乳动物的细胞周期为1030h，其中间期约10h。,（三）细胞周期,2020/4/27,30,在体外培养中，单个细胞也能生存和生长，有很大的独立性，但不是细胞永久存在的形式，不能长期生存，只有群体细胞才是细胞的基本存在形式。体外培养细胞间仍具有形态和功能的相互依存关系，细胞上仍有桥粒、缝隙连接，一旦两相邻细胞发生接触，便呈接触抑制现象，导致运动停止。,四、细胞相互关系,2020/4/27,31,无污染环境温度气体环境和氢离子浓度基本营养物质促生长因子、激素渗透压,五、细胞生存环境和代谢,2020/4/27,32,（一）无污染环境无菌、无毒是保证细胞生存的首要条件。（二）温度：35370C39400C中1h，有一定损伤，但仍可以恢复。41420C中1h，细胞严重损伤，但不致全部杀死，仍有可能恢复。430C时，很多细胞被杀死。温度00C：能抑制细胞代谢，并无伤害作用。40C数小时370C培养，细胞仍能生长。温度降至冰点以下，细胞可因胞质结冰而死亡。在培养液中加一定量保护剂（二甲基亚砜或甘油），封入安瓿中后，冻于液氮中，-1960C，能长期贮存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长，细胞的生物性状不受任何影响，此为细胞保存的主要手段。,五、细胞生存环境和代谢,2020/4/27,33,（三）气体环境和氢离子浓度所需气体主要有O2，CO2。1、O2：参与三羧酸循环，供能。缺O2，多数不能生长。一般，95%空气加5%CO2混合气体。O2分压太高，对细胞也有毒害作用。2、CO2：既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，与维持培养液的PH有直接关系。大多数细胞PH7.27.4，但各种细胞对PH的要求也不完全相同。原代细胞一般对PH变动耐受性差，无限细胞系耐受性强。总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸中更有利于生长。如：原代羊水细胞，PH6.8时最适。,五、细胞生存环境和代谢,2020/4/27,34,细胞在生长过程中，不断释放CO2，培养液变酸，为维持培养液中PH的恒定，最常用的方法是加磷酸盐缓冲剂其中，NaHCO3CO2能调节CO2的含量。NaHCO3+H2ONa+HCO3-+H2ONa+H2CO3+OH-Na+OH-+H2O+CO2。CO2易于逸出，只适用于封闭式培养。开瓶培养时，需在5%CO2气体环境中（CO2培养箱）。为克服NaHCO3的缺点，也可用Hepes（羟乙基派嗪乙硫磺酸）它对细胞无毒性，是具有较强缓冲能力的氢离子缓冲剂。主要能稳定和抵抗快速PH变化。其最大优点：开瓶通气观察也能维持PH值。,五、细胞生存环境和代谢,2020/4/27,35,（四）基本营养物质1、糖：葡萄糖、核糖、丙酮酸。2、12种基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸。谷氨酰胺：作为氮源、碳源，能促进各种氨基酸进入细胞。3、维生素：VitA、D、E、K、B族、C。4、无机盐：Fe+、Zn+、Cu+。,五、细胞生存环境和代谢,2020/4/27,36,（五）促生长因子、激素如：胰岛素-促进葡萄糖、氨基酸的吸收。氢化可的松-细胞粘着，增殖。（六）渗透压7.6个大气压（5776mmHg）=770KPa。,五、细胞生存环境和代谢,2020/4/27,37,半固体培养基按物理性状：液体培养基-最主要的。按来源分：天然培养基：合成培养基+血浆、血清、胎汁。合成培养基：据细胞所需的严格配制。无血清培养基：增添促细胞生长因子。,六、人工培养基,2020/4/27,38,除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上才能生长。细胞贴附底物生长的性质称“锚着依赖性”。原则上讲，凡对细胞无毒性的物质，都可用作底物。但不同的细胞对底物的要求各异，底物不合适，细胞生长不良。玻璃一次性塑料微载体饲细胞（也称滋养细胞）,七、附着底物,2020/4/27,39,（一）玻璃是最常用的培养底物，透明、便于观察、洗涤，能反复使用，质地以中性玻璃为上，适合于各种细胞附着生长。缺点：易破碎。（二）一次性塑料聚苯乙烯。经加工处理，表面具有亲水性，聚四氟乙烯。,七、附着底物,2020/4/27,40,（三）微载体由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体，附着面大，有利于大量繁殖细胞。天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）作载体，直径50um或数百um不等，如：微载体培养系统。（四）饲细胞（也称滋养细胞）可用小鼠成纤维细胞或其它细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖力，但还存活，仍能进行代谢活动，可支持其它细胞生长。,七、附着底物,2020/4/27,41,（一）常用术语1、细胞培养：单个细胞在体外条件下的生长。2、组织或器官培养：是指组织、器官在体外的维持或生长，它们