重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶分离纯化和鉴定

,重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化和鉴定,ppt演讲：ppt制作：组员：,目录,实验目的,实验背景和主要原理,实验试剂,实验步骤,预期结果,实验目的,了解包涵体内蛋白质分离纯化的基本原理和操作,学习亲和层析的基本原理和操作方法,学习蛋白质含量的测定方法,学习酶活性的测定方法和操作,实验背景和主要原理,甘露醇-1-磷酸脱氢酶(MTLD)是甘露醇类渗透保护剂的生物合成关键酶。我们组在之前的基因工程实验技术课程中构建了甘露醇-1-磷酸脱氢酶表达菌。成功构建重组表达质粒pET-28a(+)/MTLD，并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，已获得能大量表达生甘露醇-1-磷酸脱氢酶的重组体克隆。本实验项目为自选课题，主要内容为重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化、鉴定和活性测定。,Fructose-6-phosphate(F6P),Mannitol-1-phosphate(M1P),Mannitol,ATPFructose,Hexokinase(HK),Mannitol-2-dehydrogenase(M2DH)NAD(P)+,Mannitol-1-phosphatephosphatase(M1Pase),Mannitol-1-phosphatedehydrogenase(M1PDH),ADP,NAD(P)H,Pi,NAD+,NADH,渗透保护剂,细胞内蛋白质分离的基本步骤是：清洗细胞、裂解细胞、离心去除膜组分等获得可溶性蛋白质，然后通过盐析、层析等方法进行分离纯化，以获得蛋白产物。分离纯化的情况可用SDS-PAGE电泳检测。如果目标产物表达后形成包涵体，包涵体蛋白的分离需要经过细胞破碎、收集包涵体、洗涤包涵体（去除吸附在蛋白质表面的不溶性杂蛋白和其它杂质）、包涵体变性溶解和变性蛋白质的复性等步骤，再进行与一般蛋白质相同的分离纯化。,用pET-28a质粒载体构建的蛋白表达产物中，目标蛋白与载体上设计的组氨酸标签融合表达，可以用镍柱进行金属离子亲和纯化。金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力（如镍）吸附蛋白质的分离系统。,金属鏊合介质预装柱（镍柱）,镍柱分离蛋白原理图,材料、试剂,1实验材料重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶甘油菌（载体pET-28a，受体菌E.coliBL21）,2实验试剂咪唑、卡那霉素（Kan）、IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷）、去垢剂TritonX-100、低分子量蛋白质Marker,总提取路线,甘露醇-1-磷酸脱氢酶的诱导表达,细胞超声破碎,包涵体的清洗,包涵体的变性溶解,镍柱纯化LDH洗脱条件优化,镍柱纯化LDH,检测方法,蛋白含量测定,酶活性测定,SDS-PAGE电泳鉴定,甘露醇-1-磷酸脱氢酶的诱导表达,甘油菌,LB液体培养基中培养活化6h,按1：100接入锥形瓶中培养,IPTG,诱导4h,SDS-PAGE电泳,卡那霉素,细胞超声破碎,离心15min,蒸馏水清洗3次,收集菌体,BufferI悬浮,超声破碎40min,离心10min,SDS-PAGE电泳,去上清,上清沉淀,目的蛋白的存在部位,包涵体的清洗,超声波破碎液,离心10min,沉淀,Buffer清洗,Buffer清洗,沉淀,振荡0.5h（37）,离心10min,沉淀,BufferII清洗,沉淀,蒸馏水清洗,沉淀,注：包涵体变性前必须通过清洗尽可能去除杂质,去上清,包涵体的变性溶解,清洗后的包涵体沉淀用10mL尿素变性液（50mMTris-HCl，8M尿素，pH8.0）悬浮，可用枪把包涵体沉淀吹起来，放在震荡器振荡30min，如果还有未溶的，可以少加些变性液再震荡。等完全溶解后，12000rpm离心20min，留上清，上清直接上Ni柱。,镍柱纯化LDH,镍柱上样前先用EquilibriumBuffer（50mMTris-HCl，8M尿素，20mM咪唑，pH8.0）平衡，约三倍柱体积（15mL）。上样。用2种含不同浓度咪唑溶液15mL进行清洗和洗脱（根据上一步的结果定咪唑的2个浓度），收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳,镍柱纯化LDH洗脱条件优化,镍柱（5mL）上样前先用EquilibriumBuffer（50mMTris-HCl，8M尿素，20mM咪唑，pH8.0）平衡，约三倍柱体积（15mL）。上样。依次用6种含不同浓度咪唑溶液15mL进行洗脱，分别收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳,透析复性,方法：复性时使用稀释、透析、过滤及凝胶过滤除去变性剂、还原剂。将变性蛋白连续缓慢的加入到复性缓冲液中。复性中通过透析逐渐减少透析缓冲液中的变性剂浓度。,透析稀释复性方案如下：50mMTrispH8.0，50mMNaCl，1mMEDTA，1%甘氨酸，10%甘油，1/100稀释复性，室温过夜，20h。,蛋白含量测定：紫外分光光度法,280nm的光吸收法用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/mL。标准蛋白质用牛血清清蛋白(BSA)。,样品的测定测定样品如下：亲和层析上样液、洗脱收集液、复性液。计算蛋白含量和目标蛋白产率。,SDS-PAGE检测酶分子量和纯度,SDS-PAGE电泳测定样品：1、IPTG诱导菌体沉淀，2、IPTG未诱导菌体沉淀，3、诱导表达的菌体破碎后沉淀及上清，4、亲和层析上样液5、亲和层析的洗脱液及收集液分析提取过程各步骤酶的去向和纯度情况，并测出酶的分子量。,酶活性的测定：复性后酶液,正反应：底物（1mL）：50mMTris-醋酸（pH6.3），0.2mMNADH，2.5mMEDTA，3mMF6P(终浓度）底物中加25微升酶液，340nm波长处测吸光度,逆反应：底物（1mL）：10mMHepes-KOH(PH=9),0.5mM的NAD+,2.5mM的EDTA，0.5mM的M1P底物中加25微升酶液，340nm波长处测吸光度,预期结果,1、镍柱亲和层析图谱2、SDS-PAGE电泳图：可分析得出诱导表达量；目标物质在细胞中的定位情况和在纯化过程的去向；酶分子量大小；最终产物纯度。3、纯化过程各步骤产物的蛋白含量4、最终产品酶的活性和比活5、酶提取率,参考文献,1SylvieRousvoal,AgnesGroisillier,SimonM.Dittami等.Mannitol-1-phosphatedehydrogenaseactivityinEctocarpussiliculosus,akeyroleformannitolsynthesisinbrownalgaeJ.Planta,2011,233:261273.2袁勤生.现代酶学M.上海华工理工大学出版社,200