第七章--外源化学物致突变作用.ppt

第七章食品毒物的致突变作用,食品安全教研室,2,主要内容,第一节基本概念第二节化学毒物致突变的类型第三节致突变作用机制和后果第四节机体对致突变作用的影响第五节观察化学毒物致突变作用的基本方法,3,4,学习目的与要求,掌握有关突变和致突变试验中的一些基本概念，致突变的类型。熟悉食品毒物致突变的机制和突变的不良后果。了解机体对DNA损伤的直接修复、切除修复和错配修复以及重组修复和SOS修复的机理。,5,基本概念,遗传：地球上的生物都能通过各种繁殖方式来保证其物种以相对稳定的生命形式和状态存在于自然界，这个过程是遗传。变异:在物种的亲子之间或子代个体之间出现的不同程度的差异。,6,基本概念,突变(mutation)遗传结构本身的变化及其引起的变异称为突变，突变实际上是遗传物质的一种可遗传的变异。自发突变(spontaneousmutation)由于自然界中诱变剂的作用或由于偶然的自制、转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。诱发突变(inducedmutation)人为造成或受某种化学、物理、生物等因素诱发产生的突变，简称诱变。,7,致突变作用或诱变作用(mutagenesis)广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。化学诱变剂(chemicalmutagen)能引起致突变作用的化学物。有些化学物质具有很高的化学活性，其原型或其化学水解产物就可以引起生物体的突变，称为直接诱变剂(direct-actingmutagen)；有些化学物质其本身不能引起突变，必须在生物体内经过代谢活化才呈现致突变作用，称为间接诱变剂(indirect-actingmutagen)。,基本概念,8,基本概念,本章所用的遗传毒性和致突变性两个术语既有联系又有区别。致突变性和致癌性都是精确的概念，在一个实验群体中的突变率和癌发生率可以定量检测。遗传毒性是泛指对基因组的毒性，对基因组的毒作用可引起致突变性及其他各种不同的效应，如染色体畸变、噬菌体引起细菌死亡、DNA链断裂及细胞分裂抑制等。这些效应都可作为评价遗传毒性的终点。,9,遗传损伤的类型,根据DNA改变牵涉范围的大小，在遗传毒理学中可将遗传损伤分为三大类：基因突变染色体畸变染色体数目改变（基因组突变）,10,基因突变,基因突变(genemutation)指在基因中DNA序列的改变。基因突变是分子水平的变化，在光学显微镜下无法看见，一般是以表型(如生长、生化、形态等)的改变为基础进行检测，也可通过核酸杂交技术、DNA单链构象多态分析(SSCP)及DNA测序等方法检测DNA序列的改变来确定。基因突变可分为以下几种基本的类型：碱基置换移码突变整码突变片断突变,11,基因突变,1碱基置换(basepairsubstitution)指DNA序列上的某个碱基被其他碱基所取代。碱基置换又可分为转换和颠换两种。转换(transition)：指嘌呤与嘌呤碱基、嘧啶与嘧啶碱基之间的置换(包括G：CA：T和A：TG：C)颠换(transvertion)：指嘌吟与嘧啶碱基之间的置换(包括G：CT：A，G：CC：G，A：TC：G及A：TT：A)。,12,基因突变,13,基因突变,转换和颠换发生后的后果取决于是否在蛋白质合成过程中引起编码氨基酸的错误。错义突变(missensemutation)：如果碱基置换导致了编码氨基酸信息的改变，在基因产物中，一个氨基酸被其它的氨基酸所取代，称为错义突变。错义突变有可能使基因产物失活，也可能仅对基因产物的功能产生一定的影响或无影响，这取决于置换的氨基酸及其在蛋白质中的位置和作用。,14,基因突变,同义突变(samesensemutation)：遗传密码子具有兼并性(degeneracy)，有时，虽然有碱基置换的发生，但密码子的意义可以没有改变，此时称为同义突变。无义突变(nonsensemutation)：如果碱基置换的结果使mRNA上的密码子由氨基酸编码密码子变成非编码的终止密码(UAG、UGA、UAA)，称为无义突变。无义突变可使蛋白质合成提前终止，导致基因产物不完全或无功能。,15,基因突变,2移码突变(frameshiftmutation)指改变从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变，通常涉及在基因中增加或缺失一个或两个碱基对。DNA链碱基排列及密码的阅读是连续的，在基因中一处发生移码突变，会使其以后的三联密码子都发生改变，有时还会出现终止密码，所以，移码突变往往会使基因产物发生大的改变，引起明显的表型效应，常出现致死性突变。,16,基因突变,17,基因突变,3.整码突变整码突变(codonmutation)又称为密码子的插入或缺失，指在DNA链中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子，此时基因产物多肽链中会增加或减少一个或几个氨基酸，此部位之后的氨基酸序列无改变。,18,基因突变,4.片断突变指基因中某些小片段核苷酸序列发生改变，这种改变有时可跨越两个或数个基因，涉及数以千计的核苷酸。主要包括核苷酸片段的缺失、重复、重组及重排等。缺失指基因中某段核苷酸序列的丢失，缺失范围小，也称为小缺失。重复指基因中增加了某一段重复的核苷酸序列。缺失和重复都可能打乱基因的读码顺序，引起移码突变。重组指两个不同基因的局部片段的相互拼接和融合。重排则指DNA链发生两处断裂，断片发生倒位后再重新接上。根据突变后基因产物功能的改变，基因突变可分为正向突变及回复突变。正向突变(forwardmutation)是导致基因产物正常功能丧失的突变，回复突变(reversemutation)则指使基因产物的功能恢复的突变。,19,染色体畸变,染色体和染色质染色质：真核细胞间期细胞核内伸展开的DNA蛋白质纤维。染色体：真核细胞有丝分裂期高度螺旋化的DNA蛋白质纤维，是间期染色质进一步紧密盘绕折叠的结果。染色质和染色体是真核细胞内遗传物质DNA分子的存在形式；这种结构形式对遗传信息的稳定、传递和表达都有极为重要的影响。,20,染色体畸变,21,染色体畸变,人体内每个细胞内有23对染色体.包括22对常染色体和一对性染色体.性染色体包括：X染色体和Y染色体。含有一对X染色体的受精卵发育成女性，而具有一条X染色体和一条Y染色体者则发育成男性。染色体在形态结构或数量上的异常被称为染色体异常，由染色体异常引起的疾病为染色体病。现已发现的染色体病有100余种，染色体病在临床上常可造成流产、先天愚型、先天性多发性畸形、以及癌肿等。,22,染色体畸变,23,24,染色体畸变,人类X染色体(左)和Y染色体(右),25,染色体畸变,26,二、染色体畸变(chromosomeaberration)指染色体的结构改变，染色体畸变牵涉的遗传物质改变的范围比较大，一般可通过在光学显微镜下观察细胞有丝分裂中期相来检测。染色体结构改变的基础是DNA链的断裂，所以把能引起染色体畸变的外源化学物称为断裂剂(clastogen)。染色单体型畸变(chromatid-typeaberration)组成染色体的两条染色单体中仅一条受损染色体型畸变(chromosomeaberration)两条染色单体均受损,染色体畸变,27,染色体畸变,28,染色体畸变,1.裂隙(gap)在一条染色单体或两条染色单体上出现无染色质的区域，但该区域的大小等于或小于染色单体的宽度。在制备染色体标本过程中，会因各种因素的影响形成裂隙，故认为裂隙并非染色质损伤，所以，在计算染色体畸变率时通常不考虑裂隙。,29,染色体畸变,2.断裂(break)同裂隙，但无染色质区域的大小大于染色单体的宽度。,30,3.断片(fragment)和缺失(deletion)染色体或染色单体断裂后，无着丝粒的部分可与有着丝粒的部分分开，形成断片，有着丝粒的部分称为缺失。发生在染色体或染色单体末端的缺失称为末端缺失，发生在臂内任何部分的缺失称为中间缺失。,31,4.微小体(minutebody)中间缺失形成的断片有时很小，成圆点状，称为微小体。5.无着丝点环(acentricring)无着丝粒的染色体或染色单体断片连在一起呈环状。,32,染色体缺失及环状染色体的形成图,染色体插入和重复示意图,33,染色体畸变,6.环状染色体(ringchromosome)染色体两条臂均发生断裂后，带有着丝粒部分的两端连接起来形成环状。通常伴有一对无着丝点的断片。7.双着丝点染色体(dicentricchromome)两条染色体断裂后，两个有着丝粒的节段重接，形成双着丝点染色体。属于不平衡易位。8.倒位(inversion)在一条染色体或染色单体上发生两处断裂，其中间节段旋转180后再重接。如果被颠倒的是有着丝点的节段，称为臂间倒位；如被颠倒的仅是长臂或短臂范围内的一节段，称为臂内倒位。,34,染色体的臂间倒位,染色体相互易位示意图,35,9.易位(tranlocation)当两条染色体同时发生断裂后，互相交换染色体片段。如果交换的片段大小相等，称为平衡易位(balancedtranslocation)。,36,10.插入(insertion)和重复(duplication)一条染色体的断片插人到另一条染色体上称为插入。当插入片段使染色体具有两段完全相同的节段时，称为重复。11辐射体染色单体间的不平衡易位可形成三条臂构型或四条臂构型，分别称为三辐射体(triradial)及四辐射体(quadrirdial)。在三个或多个染色体间的单体互换则可形成复合射体(complexradial)。,37,染色体畸变,38,三、基因组突变基因组突变(genomicmutation)指基因组中染色体数目的改变，也称为染色体数目畸变(numericalaberration)。1非整倍体非整倍体(aneuploid)指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单体(monosome)，增加一条染色体时称为三体(trisome)。染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。2整倍体整倍体(euploid)指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)等。在人体，3n为69条染色体，4n为92条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。,基因组突变,39,多倍体植物,40,41,42,致突变作用的机制,一、DNA损伤与突变(一)碱基损伤1.碱基错配2.嵌入DNA链3.碱基类似物的取代4.碱基的化学结构改变或破坏,43,一、DNA损伤与突变（二）DNA链受损1.二聚体的形成2.DNA加合物（DNAadducts）形成3.DNA-蛋白质交联物(DNA-Proteincrosslinks，DPC)形成二、引起突变的细胞分裂过程的改变三、其他的改变对DNA合成和修复有关的酶系统作用可间接导致DNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。,致突变作用的机制,44,突变的不良后果,45,一、机体修复DNA损伤的机制可分为两大类：1.损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤。2.修复机制：,DNA修复,直接修复,切除修复,O6甲基鸟嘌呤修复,光修复,错配碱基修复,碱基切除修复,核苷酸切除修复,机体对致突变作用的影响,复制后修复,呼救性修复,46,机体对致突变作用的影响,二、遗传因素对致突变作用的影响：(一)代谢酶遗传多态性(二)修复功能的个体差异,47,观察化学毒物致突变作用的基本方法,一、观察项目的选择1观察的效应终点类型基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(geneticendpoint)。,48,观察化学毒物致突变作用的基本方法,一、观察项目的选择遗传学终点分为5类：DNA完整性的改变(形成加合物，断裂，交联)；DNA重排或交换；DNA碱基序列改变；染色体完整性改变；染色体分离改变。其中实际上指基因突变，指染色体畸变。,49,观察化学毒物致突变作用的基本方法,2成套的观察项目遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，或生殖细胞，或两者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统，如S9来弥补缺乏活化系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。,50,2成套的观察项目关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选的原则有：选择的遗传毒性试验应包括5种类型的遗传学终点。通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。体内试验与体外试验配合。应包括生殖细胞和体细胞。通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,51,二、常用的致突变试验(一)细菌回复突变试验(Ames试验),鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株。(his-),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,观察化学毒物致突变作用的基本方法,52,二、常用的致突变试验(二)微核试验微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验(Micronucleustest，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,53,观察化学毒物致突变作用的基本方法,(二)微核试验,54,MN,NCE,观察化学毒物致突变作用的基本方法,55,二、常用的致突变试验(三)染色体畸变分析(四)姐妹染色单体交换试验（SCE）,观察化学毒物致突变作用的基本方法,56,二、常用的致突变试验(五)果蝇伴性隐性致死试验(六)显性致死试验(七)程序外DNA台成试验(八)转基因动物致突变试验(九)哺乳动物细胞基因突变试验,观察化学毒物致突变作用的基本方法,57,三、致突变试验中的一些问题(一)阴性和阳性对照的设立1阴性对照它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，Ames试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。2阳性对照是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,58,三、致突变试验中的一些问题(二)体外试验的活化系统1哺乳动物细胞介导使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。2S9S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。3纯化酶和基因工程应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,59,三、致突变试验中的一些问题(三)致突变试验与致癌试验的关系已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,60,三、致突变试验中的一些问题(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用阴性结果判定条件：最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以5000g皿作为最高剂量。各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,61,三、致突变试验中的一些问题(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用阳性结果应具有剂量反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际后果尚不明确。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,62,致突变试验举例,美国EPA毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染色体畸变试验)；第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改变或生