第10章核酸的生物合成

第十章核酸的生物合成,基因(gene)：为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。基因组（genome)：某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。,转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录,*中心法则(thecentraldogma),转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录,转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录,转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录,转录翻译复制DNARNA蛋白质逆转录,主要内容DNA的生物合成复制RNA的生物合成转录蛋白质的生物合成翻译基因重组与基因工程,第一节DNA的生物合成DNABiosynthesis,一、DNA的复制二、逆转录三、DNA的损伤和修复四、多聚酶链式反应（PCR）,一、DNA的复制,DNA分子是如何通过复制把遗传信息高度保真性地（fidelity）传递给子代细胞的？,一、DNA的复制,概念：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。,（一）复制的基本规律,1、半保留复制,DNA半保留复制示意图,Watson和Crick于1953年假定DNA的复制为半保留复制。,全保留式半保留式混合式,DNA复制的三种可能方式,1958年M.Meselson和F.M.Stall利用同位素15N标记大肠杆菌，首先证明了DNA半保留复制。,15N-15N,14N-14N,15N-14N,半保留复制的生物学意义,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin)。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。,2.有一定的复制起始点,放射自显影证实亲代链解开后立即进行复制，没有发现单链DNA。,细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列,习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。,3、复制方式,E.coil基因结构与复制起点,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),DNA的双向复制示意图,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35。由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。,4、半不连续复制,领头链(leadingstrand),随从链(laggingstrand),DNA的半不连续复制,半不连续复制动画,冈崎片段：1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。原核生物:10002000个核苷酸真核生物:100200个核苷酸,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(laggingstrand)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,（二）DNA复制的体系底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合酶:依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)模板:解开成单链的DNA母链引物:提供3-OH末端的寡核苷酸其他酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶,复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应的特点,以DNA单链为模板以dDNA为原料引物提供3OH聚合方向为53,1、拓扑异构E（动画）,DNA复制过程中正超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,拓扑异构酶的作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶拓扑异构酶,分类,拓扑异构E,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用,通过催化DNA拓扑结构的变化，减少由于解链形成的张力,解链,双螺旋存在张力,DNA拓扑异构酶,张力解除,双螺旋变成松弛状态,解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,2.解旋酶,3、单链DNA结合蛋白(SSB),保护单链DNA免遭核酸的降解。防止单链再次形成双链降低DNA的Tm，促进DNA解链。,SSB,4、引发酶和引发体,引物酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶，该酶以DNA为模板，合成一段RNA引物，为DNA聚合酶提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。,引物,引物酶,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引发体的组装形成,引物酶的作用：为DNA聚合酶提供自由的3OHRNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,5、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合酶活性2.核酸外切酶活性大肠杆菌中至少有5种，分别命为DNA聚合酶、。,DNA聚合酶I（单体酶：单肽链）主要功能：负责DNA的损伤修复及在DNA复制中切除引物，填补空隙的作用。若用枯草杆菌蛋白酶处理此酶，可得两个片段。,蛋白酶切口,Klenow片段的分子结构,大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenowfragment。,53聚合酶活性,35外切酶活性,53外切酶活性,?,能切除突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,35外切酶活力,DNA聚合酶I小结,DNA聚合酶（单体酶）主要功能参于DNA的损伤修复，具有53聚合活力，较弱，35外切活性。但无53外切活性。DNA聚合酶（寡聚酶）是催化大肠杆菌DNA复制的主酶，全酶有10种亚基，含Zn2+。,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,原核生物DNA聚合酶,真核DNA聚合酶,聚合酶,DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,6、DNA连接酶,功能连接复制过程形成的DNA片段,形成一个3,5-磷酸二酯键,连接酶,连接酶,DNA连接酶的连接作用,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,DNA连接酶催化的条件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的作用,DNA复制酶系总览,（三）原核生物DNA复制,以四种dNTP为底物在DNA模板指令下，按碱基配对的原则，由DNA聚合酶催化，向DNA的3OH端添加核苷酸，以53的方向合成与模板互补的新链。,1、复制的起始,原核生物：特定位点开始，特定位点终止，只有一个复制子。（基因组能独立进行复制的单位）。真核生物：多个位点起始，多复制子。大肠杆菌复制起始点：oriC（original）终止点：ter（terminate）,一些特殊的Pr可以识别并结合到复制起点，随即使DNA双螺旋局部解链，形成复制眼，在其两端的DNA的两股链呈丫字状，称为复制叉。分别向两侧进行复制，通常复制叉双向等速前进，,迅速生长的细菌，第一轮复制未完成就启动第二次复制。,DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。1解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,2引发体组装和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体；在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH3,3,DNA复制的延长过程,2、DNA链的合成与延伸,领头链的合成过程,随从链的合成过程,复制过程简图,DNA复制系统,SSP,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,E.coli,ori,ter,82,32,ori,ter,SV40,50,0,3、复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,（1）去除引物，填补缺口：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,（2）连接冈崎片段,随从链上不连续性片段的连接,拓扑异构酶将两个子代DNA环分离,为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1遵守严格的碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3对复制过程中出现的错误及时进行校正。,DNA复制的保真性(fidelity)：,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现外切酶活性。,（四）真核生物DNA复制,真核细胞染色体DNA分子为线性的。比原核细胞DNA分子大，复制更为复杂。为多复制子复制（多起点双向复制），在全部染色体复制完成前，各复制子不能再开始新一轮复制。,真核生物DNA复制起始复合物的组装和激活分属于不同的细胞周期。,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,真核生物端粒的形成：,在DNA复制的同时另外还要组装成核小体。,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,端粒酶(telomerase),端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶的分子结构,端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT),端粒酶的组成,端粒酶的爬行模型（动画演示）,端粒酶(telomerase)的作用机制爬行模型,二、逆转录,以RNA为模板，由RNA指导的DNA聚合酶（逆转录E）催化，合成DNA的过程。,逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象：,1、逆转录酶的性质,寡聚E兼具有三种酶的活力:RNA指导的DNA聚合E活力DNA指导的DNA聚合酶活力RNaseH（核糖核酸酶H）活力RNaseH：53和35外切酶活力，可除去DNA、RNA杂交分子中的RNA。,2、逆转录病毒逆转录过程,RNA（+）RNA（+）/cDNA（-）DNA（+）/cDNA（-）RNA（+）,3、逆转录的生物学意义,逆转录过程的发现，扩充了中心法则。它有助于人们对RNA病毒致癌机制的了解，并对防治肿瘤提供了重要线索。逆转录酶已成为分子生物学和基因工程中常用的一种工具酶，利用它可以从mRNA合成相应的cDNA，在基因结构研究、氨基酸序列预测以及基因工程中具有十分重要的意义。,三、DNA的损伤和修复,1、DNA的损伤X射线、紫外线照射DNA，引起损伤。如形成胸腺嘧啶二聚体。,嘧啶二聚体的形成,（二）DNA损伤的修复,DNA损伤修复(repair)：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。,光修复(lightrepair)切除修复(excisionrepair)重组修复(recombinationrepair)SOS修复,修复的主要类型：,1、直接修复（光修复）,可见光（400500nm）激活光裂合酶，将嘧啶二聚体分开，恢复成单独的嘧啶碱基，对单细胞生物比较重要，高等哺乳动物无光裂合酶。,修复过程由光裂合酶(photolyase)催化完成。,光裂合酶的分子结构,直接修复,这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,2、切除修复（复制前修复）,（1）切断：专一性的内切酶在靠近二聚体处切断单链DNA。（2）修复合成：DNA聚合酶在断口处进行局部修复合成。（3）切除：5核酸外切酶切去嘧啶二聚体片段。（4）连接：连接酶将新合成的DNA链与原来的DNA链连在一起。,切除修复,3、重组修复（动画）,