第二章--提取、分离与鉴定的方法与技术4.ppt

第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术,学习目标：1.熟悉系统溶剂分离法的原理及应用。2.掌握两相溶剂萃取法的原理和操作技术。3.掌握分配系数的概念。4.熟悉两相溶剂萃取法的溶剂选择。,第一节提取方法与技术,第二节分离精制和鉴定的方法与技术,第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术,第二节分离精制和鉴定的方法与技术,一、系统溶剂分离法,第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术,二、两相溶剂萃取法,三、沉淀法,四、结晶与重结晶法,五、透析法,六、分馏法,七、色谱法,第二节分离精制和鉴定的方法与技术一、系统溶剂分离法是一种按极性由小到大的顺序选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次分离提取液中的各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分离的方法。操作技术：提取液适当浓缩，或拌入适量随性吸附剂如粗硅胶、纤维素粉、硅藻土等，低温或自然干燥后，依次选用37种不同极性的溶剂（石油醚或苯、乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水），由低极性至高极性分步对总提取物进行提取分离。因总提取物中各类成分的极性不同，可被相应极性的溶剂所分离。也可以选择其中的三、四种不同极性的溶剂组成溶剂系统，按极性由低到高分步进行抽提，分成若干部位。,适用范围：适用于有效成分尚未明确的天然药物提取液的分离。特点：操作繁琐，相同成分会分散在不同的抽提部位，不易收集。微量成分、结构相似成分的纯化分离受限制。提示：在研究不明成分中最为常用。,天然药物成分极性天然药物成分类型适用的提取溶剂强亲脂性挥发油,脂肪油,蜡,甾醇类,石油醚,已烷脂溶性色素,某些苷元亲脂性苷元,生物碱,树脂,醛,酮,乙醚,氯仿醇,酯,有机酸,某些苷类中等极性某些苷类（如强心苷等）氯仿:乙醇(2:1)某些苷类（如黄酮苷等）乙酸乙酯某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）正丁醇亲水性极性很大的苷,糖类,丙酮,乙醇,甲醇氨基酸,某些生物碱盐强亲水性蛋白质,黏液质,果胶,糖类,水氨基酸,无机盐类,第二节分离精制和鉴定的方法与技术,一、系统溶剂分离法,第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术,二、两相溶剂萃取法,三、沉淀法,四、结晶与重结晶法,五、透析法,六、分馏法,七、色谱法,二、两相溶剂萃取法*(液-液萃取法、萃取法）1概念：是指在提取液中加入一种与其不相混溶的溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各种成分在两相溶剂中分配系数不同而将所需成分萃取出来的分离方法。2基本原理：利用混合物中各成分在两相溶剂中的分配系数（K）不同而达到分离的方法。分配系数*：是指在一定温度和压力下，某物质溶解在两种不相混溶的溶剂中，当达到动态平衡时，根据分配定律，该物质在两相溶剂中浓度的比值为一常数，称为分配系数（K），即：K=Cu/CL,分离难易可用分离因子表示。分离因子：是两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。即：=KA/KB一般地，100，只需一次即可分离；10010，需经1012次才能达到分离；1，即KAKB，两种成分性质相似，无法分离,两相溶剂萃取法的“两相”一般是指互相饱和的水相与亲脂性有机溶剂相，混合物中各成分在两相溶剂中分配系数差别越大，则越容易分离，分离效果越高。,3萃取溶剂的选择萃取溶剂的选择应遵循下列原则：(1)萃取溶剂应与原溶剂不相混溶或仅能部分混溶，振摇、静置后，应能较好地分层。(2)有效成分(或杂质)在萃取溶剂中应有较大的溶解度，而杂质（或有效成分）在萃取溶剂中的溶解度要小，即二者的分配系数应有一定的差别，差别越大越容易分离。注：两相溶剂的极性应有一定差异，极性差别太小或太大，分离效果都不好。酸、碱性成分常用pH梯度萃取法分离。,酸、碱、两性成分调节pH改变的分子存在状态改变溶解度,根据物质的溶解度差异进行分离调节pH,解离型/离子态,H+,BH+,B,OH-,H+,A-,HA,OH-,脂溶性,水溶性,pH梯度萃取法*：利用混合物中各成分酸(或碱)性强弱不同，相应改变溶液pH值使成分相继成盐或游离，改变其在溶剂系统中的分配系数而与其他成分达到分离的方法。如：黄酮苷元的分离。利用黄酮类化合物酸性强弱不同，先将其苷元溶于有机溶剂，然后依次用pH值由低到高的碱液萃取，使黄酮类成分与碱成盐后被依次萃取而分离。又如：生物碱的分离。生物碱多具有碱性，可用酸水进行提取，然后用pH由低到高的碱调节溶液pH值，使生物碱按碱性强弱不同依次游离，再用有机溶剂依次进行萃取而达分离。,药材+酸水溶液,酸水提取液,生物碱盐,生物碱具有亲脂性，不溶或难溶于水，可溶于有机溶剂。因结构中含有氮原子，具有碱性，提取时常用酸水为溶剂进行，酸水提取液碱化后，用有机溶剂进行萃取，从而与水溶性杂质达到分离。,用碱水调节溶液pH值至碱性(碱化),使生物碱转为游离状态后再用氯仿等有机溶剂进行萃取。,水溶性杂质（留在水中）,（1）简单萃取法（2）逆流连续萃取法（3）逆流分溶法（CCD，countercurrentdistribution）（4）液滴逆流分配法（色谱）（DCCC，dropletcountercurrentchromarography）（5）纸色谱（PC，paperchromatography）（6）液液分配柱色谱（7）高速逆流色谱（HSCCC，highspeedcountercurrentchromarography）,4萃取技术,50A有机溶剂/水B有机溶剂/酸、碱水pH物质存在状态溶解性KCpH梯度萃取梯度调节pH，每次改变一种成分的存在状态，依次分离特点：操作简便，设备简单，实验室常用。但溶剂用量大、易乳化。适用范围：适用于分配系数差异较大成分的分离。,（1）简单萃取法*(分次萃取)：是常用的一种萃取方法，小量萃取可使用分液漏斗进行。,例：HA1、HA2、B，且HA1HA2，如何分离?,pH12BA-3BH+HA,提示：若分离水提取液中的成分，则水提取液浓度不可过稀或过浓。过稀，萃取溶剂用量过大；过浓，两相溶剂不易充分接触，影响萃取效果。一般水提取液比重在1.11.2之间为宜；萃取溶剂与提取液应保持一定比例，第一次萃取一般为提取液的1/31/2，以后用量为1/61/4；分配系数差别较大时，一般萃取34次即可。若亲水性成分不易转入有机溶剂层时，需要增加萃取的次数或更换新的萃取溶剂；防止乳化。碱性水提取液，用氯仿萃取时，易发生乳化现象，萃取时应尽量防止乳化，如：采用旋转混合方式，避免强烈振摇，或改用氯仿和乙醚混合溶剂作萃取剂等。,若已经形成乳化层，采用破乳措施*：较长时间放置；轻度乳化可用细金属丝或细玻棒在乳化层中搅动；加入食盐以饱和水溶液，增加水的密度；滴入数滴戊醇,改变其表面张力，使乳化层破坏；乳化严重时可分出乳化层，用加热、冷冻、将乳化层抽滤或更换新溶剂进行萃取等方法处理；根据实际情况不同，还可以加入其他破坏乳化的物质，如乙醇、磺化蓖麻油等。中量萃取可使用下口瓶，工业生产上大量萃取可在密闭的萃取罐内进行。,(2)逆流连续萃取法逆流连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。是利用两相溶剂密度不同，即相对密度小的作为分散相（流动相）逆流连续穿过相对密度大的固定相，在相对运动中,使提取液中的不同成分因分配系数差异分溶于两相溶剂中而达到分离。操作技术：逆流连续萃取装置是用一根或数根萃取管串联制成。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。装置见图：,例如：用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素将氯仿装于萃取管内，开启活塞，则水提取液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大、萃取就比较完全。如果用的是比水轻的溶剂如苯、乙酸乙酯等进行萃取，则水提取需装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取过程中可用薄层色谱、纸色谱及显色反应或沉淀反应随时检查萃取是否完全。适用范围：各种密度的溶剂萃取。特点：操作简便，萃取较完全。提示：可以避免乳化现象产生。,(3)逆流分溶法（CCD)：是一种在加样量一定，容量也一定的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而使混合物中的各种成分分离的方法。也称逆流分配、逆流分布或反流分布法等。,适用范围：中等极性、分离因子较小（50）及不稳定的物质。工作原理：多次、连续的液液萃取特点：避免手工操作，分离效率高，操作条件温和，试样回收容易。但溶剂用量大，机械操作导致破损、漏液、易乳化。提示：混合物各成分的分配系数很接近时，一般方法不易分离时可用此法。但操作繁琐，消耗溶剂多，含量微小的成分易损失于大体积的溶液中，易乳化等，极性过大或过小的成分，或分配系数受温度或浓度影响过大及易乳化的溶剂系统均不宜采用此法。,(4)液滴逆流分配法(DCCC)：是利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。可有效防止乳化现象的产生。,流动相液滴垂直上下，经过固定相液体,操作技术：装置：分为三个部分。微型泵、移动相溶液贮槽和试样液注入品组成输液部分；第二部分由300-500根内径约2mm、长度为20-40cm的萃取管连接而成；第三部分由检出器和分步自动收集仪组成。操作：先将选择好的两相溶剂中的固定相充入全部萃取管内，然后从加样口注入已溶于（1:1）两相溶剂中的待分离试样，再由微型泵注入移动相，移动相在萃取管中形成液滴，不断地与固定相有效地接触、摩擦形成新的表面，促使演技在两相溶剂中实现充分的分配，获得很高的分离效果。不易乳化或产生泡沫，若用氮气驱动流动相，可避免被分离成分的氧化。