第三章-基因组文库的构建.ppt

第三章基因文库的构建和筛选,来自单个基因组的DNA片段克隆的集合体称为基因文库（genelibrary或genebank）。它包括基因组文库（genomiclibrary）和cDNA文库（cDNAlibrary）。DNA文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。cDNA文库是克隆的重组cDNA的总和，通常是建立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。无论是建立基因组文库还是cDNA文库，其目的是：从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆。,第一节基因文库的构建,一、基因组文库和cDNA文库基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群。其中可能含有基因外显子、内含子、基因5端调控区、3端的尾随序列以及基因间的间隔区。典型的基因组文库应能“代表”整套的DNA片段，这些序列和原来样本中存在的所有DNA序列相一致，并保持原有的相关丰度。当需要时，人们能从DNA文库中分离任何特定的基因片段。,噬菌体克隆文库的构建。(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中来构建基因组文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。(b)噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到扩增。,用噬菌体置换型载体构建基因文库。用限制性酶消解噬菌体载体，切除了中央的片段，再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约15kb的酶切片段随机地和噬菌体载体的两臂连接，形成线性的重组的串联体。用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗粒。用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。,一个典型的基因组文库含带有重叠基因片段的多拷贝克隆。(a)用从原有的克隆DNA片段制备的放射性探针能从典型的基因组文库中分离各种基因片段。用探针1可用来筛选文库，从文库中分离重组DNA片段。用探针2和3来获得与上述片段部分重叠的DNA序列。罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。(b)从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重叠DNA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的基因组DNA中含有三个转录的基因。,建库的关键是如何产生足够数量的重组DNA，即基因库要建多大才能保证基因组文库的完整性和代表性。1975年由L.Clarke和J.Carbon建立了Clarke-Carbon公式，用来估计一个完整的基因文库所需的克隆数，对于构建基因组文库有重要的指导意义。,克隆数的确定,Clarke-Carbon公式,任一DNA序列在文库中出现的概率：N：该序列需要克隆的总数；P：待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为99；I：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb;G:基因组DNA的总长度，如人类为3109bp,将数据代入上式=7105N的含义是克隆大小为20kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在7105个以上克隆时，才能以99的概率得到此克隆。,二、构建基因文库的克隆载体和筛选策略,构建基因组文库的第一步是将基因组DNA用限制性酶切成小片段，但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型,噬菌体克隆文库的构建。(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中来构建基因组DNA文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。(b)噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。,三、亚克隆,所谓亚克隆（sub-clone）就是对已经克隆的目的DNA片段经限制性酶消解后再次重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或进行“重编程”。亚克隆的基本过程：制备目的DNA片段和载体；连接目的DNA片段和载体；重组载体转化到宿主中；筛选重组子。,限制性酶消解用来构建克隆DNA的物理图谱,用酶（Kpn和Hind）来剪切载体，构建一个Sal插入片段的不完全酶切图谱。,M：标记泳道，是含有已知不同长度的DNA，用来衡量样本DNA的分子大小。1：Sal-Kpn；2：Hind；3：Sal-Hind；4：Kpn-Hind；5：EcoR；6：Sal-EcoR；7：KpnEcoR；8：Hind-EcoR,M12345678M,将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略,根据已知的酶切图谱进行定向克隆（directedcloning）；用常用的限制性酶交错剪切或平切进行随机亚克隆。这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶或机械的方法随机地切成小片段，插入到载体上，建立基因文库，然后从中筛选出所需要的基因或序列，或是将小片段逐一测序，再拼接成序列图谱。,第二节cDNA文库的构建和筛选,因来自不同类型细胞的总RNA中，各种RNA丰度不同。故Clarke-Carbon公式不能用来计算构建cDNA文库时所需的克隆数，考虑到cDNA文库将至少要含有5105的个重组体，可根据RNA的复杂性估计的计算方法和经验来确定。其计算公式是：,公式中“N”表示完整的cDNA文库应含有的克隆数；“p”是待克隆基因序列在文库中设定出现概率，一般为99。“n”是细胞中最稀有的mRNA的拷贝数；“T”为细胞中各种mRNA的总拷贝数。如哺乳动物细胞中约含560,000个mRNA，若分析的基因在细胞中仅有8个拷贝，那么带入公式，N3.3106，表明所构建的cDNA文库必须在3.3106个克隆以上时，才能以99的概率得到此基因。,一、mRNA的分离纯化,mRNA的提纯涉及到两个基本的步骤：将细胞总的RNA和DNA及蛋白质分开，用蛋白质强变性剂来抑制细胞中的RNase，防止RNA降解；用寡聚dT亲和基质将mRNA和其他的RNA（tRNA及rRNA等）分开。,从组织培养细胞中分离mRNA的通用方法,用硫氰酸胍和寡聚dT纤维素柱从组织培养细胞中分离纯化RNA。a.用苯酚和氯仿提取后，在酸性条件下总RNA留在水相，然后用异丙醇沉淀。b.RNA溶于高盐溶液(0.5MNaCl)中，过寡聚dT纤维素柱，完整的RNA能用甲醛琼脂糖凝胶电泳，用EB染色进行分析,二、cDNA合成,用寡聚dT为引物(一个长1218nt的多聚dT链)能获得总cDNA。因为这个引物的靶序列是mRNA的3端的多聚腺苷尾巴。但很多人和小鼠的基因3端含有一段很长的非编码的尾随序列（tailersequence），因此寡聚dT从3端的多聚腺苷尾巴引发的cDNA合成，有时要越过很长的尾随序列区，而在未达到编码区时反应就已终止，因此文库有可能丢失全部的ORF序列。,合成cDNA三种不同策略的优缺点。cDMA的第一条链的合成能用寡聚dT，随机引物或基因特异性引物来起始以达到不同的结果。,用E.coli的RNaseH和DNApolI合成cDNA的第二条链。,phagemid噬菌粒，噬粒：是嵌合噬菌体质粒克隆载体（cloningvector），它同时含有双链和单链的复制起点。如携带M13(或类似)噬菌体的复制起始点的质粒，噬菌体的复制起始点使质粒由另一个助噬菌体提供噬菌体功能时，作为单链DNA噬菌体基因组可得到复制。噬粒将质粒的通用性与噬菌体产生单链DNA的能力结合起来。这样产生单链DNA的载体用于测序、体外诱变和探针合成等。噬粒载体导入宿主、载体筛选及重组体筛选的方法与质粒相同。插入DNA的大小也与质粒一样。主要用于产生单链DNA。,三、cDNA克隆载体,ZapcDNA克隆载体来自腺病毒系统，属于噬菌粒（phagemid）载体。线状的ZapcDNA克隆载体在体内能通过噬菌粒获救(phagemidrescue)变成环状的表达载体。(a)噬菌体连续感染两个不同的E.coli菌株，在这两个菌株中一个噬菌体不受“限制”，而另一个受到“限制”。结果,在kanr菌落中获救，此菌落中含有多个拷贝的双链质粒。,pBk-CMV(4513bp),f1ori,PA,PA,O,CMV,插入的cDNA,SV40,pr,kanr/neor,(b),ZapcDNA克隆载体含有真核基因调节元件，可在哺乳动物细胞中高水平的表达插入的cDNA,通过neor标记可选择稳定的DNA重组体。,(cytomegalovirus)巨细胞病毒,第三节cDNA文库的筛选,间接用探针筛选噬菌体cDNA文库最常用的有三种方法：（1）预知相关氨基酸密码子的简并寡核苷酸探针；（2）纯化蛋白质的相应抗体探针；（3）针对差异表达基因的扣除cDNA探针。,探针的特异性可通过以下的策略来解决：选基因的特异序列为探针；长度不低于1720nt；控制退火温度。碱基的简并性可通过以下的策略来解决：选用简并程度最低的序列；选用使用频率最高的密码子；简并密码子的第3个碱基可用H；应用混合探针；控制退火温度。,一、简并寡核苷酸探针,应用混合探针分离克隆基因虽取得了良好的效果，但也会产生相当数量的假阳性。克服假阳性的方法有二:(1)制备猜测体探针；猜测体探针是根据特定物种某已知蛋白的密码子使用频率，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行人工合成的低简并性寡核苷酸探针。,猜测体探针的制备原理,猜测体探针只要有85的碱基能和目的基因配对即可杂交。如连续的配对区较长(达1012nt),那么猜测体探针作用的强度足以鉴定出含目的基因的阳性克隆。如错配的核苷酸均匀分散在探针分子的各部位，那么这种猜测体探针就不会和目的基因的序列杂交。提高杂交温度，以减少假阳性。,(2)PCR猜测体技术,测定尿酸氧化酶末端一段32aa的序列；根据此段顺序两侧的序列推测,合成一组引物;从猪肝中提取mRNA,反转录成cDNA,用以上述引物对此cDNA进行特异扩增。扩增产物连接到载体上进行克隆，并用唯一猜测体探针进行杂交，选择阳性克隆。此猜测体探针是按32aa序列推导猜测而来的。分离的克隆中部为上述32aa,两端为引物序列。用这段插入序列为探针，在严格条件下筛选噬菌体cDNA文库。,PCR猜测体技术,二、抗体探针,蛋白质特异性抗体能用作免疫探针来探测细菌功能蛋白编码的蛋白质抗原。用噬菌体表达载体产生功能性蛋白，通过滤膜杂交检测，进行抗体筛选cDNA文库是是容易的。用抗体筛选最常用的cDNA克隆载体是gt11和Zap噬菌体载体。它们含有大肠杆菌转录启动子，连接于-半乳糖苷酶（lacZ）的编码序列上。通过插入在载体的lacZ编码序列中的cDNA片段，能产生重组噬菌体，它在被感染的细菌中表达LacZ-cDNA融合蛋白。,用抗体鉴别阳性克隆。用噬菌体载体gt11构建的表达文库可用蛋白特异性抗体来筛选。膜上未结合的抗体将被洗脱掉。结合的抗体通过结合的具有放射性的二抗来筛选,三、差示杂交,差示杂交(differentialhybridization)1.差别杂交要拥有两种细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，而另一细胞群体中目的基因不表达。2.制备两种不同的mRNA提取物。一种含一定比例目的基因mRNA的总mRNA;另一种不含目的基因mRNA的总mRNA;3.通过这两种总mRNA为探针的平行杂交对目的基因cDNA克隆文库进行筛选。,两种差别表达的细胞。高度特异活性的cDNA探针和两个重复的滤膜杂交，来鉴别含有差异表达的cDNA插入序列的噬菌斑。差示杂交的步骤是富集的过程，而不是纯化。很多的转录物仍然充当扣除探针。候选cDNA必须用RNA印迹分析编码转录物的表达模式来检测,表达目的基因的细胞不表达目的基因的细胞,提取mRNAcDNA提取mRNA,RT,制备带有放射重组到制备带有放射标记的cDNA探针载体上标记的cDNA探针,与影印的NC转染E.coli与影印的NC,进行分子杂交构成cDNA文库进行分子杂交,比对比对,筛选出含目的基因的阳性克隆,影印影印,放射自显影筛选放射自显影,两种差别表达的细胞。高度特异活性的cDNA探针和两个重复的滤膜杂交，来鉴别含有差异表达的cDNA插入序列的噬菌斑。差示杂交的步骤是富集的过程，而不是纯化。很多的转录物仍然充当扣除探针。候选cDNA必须用RNA印迹分析编码转录物的表达模式来检测,差别杂交缺点：(1)灵敏度低(2)重复性差(3)需用大量的杂交膜，工作量大，费时，费钱，故可用差别杂交来筛选，扣除杂交也可用来分析缺失突变基因。,四、扣除杂交,扣除杂交(subtractedhybridization)也称为消减杂交其原理是从表达目的基因的组织（简称+）提取总mRNA，通过用RTase和32P-dNTP，将mRNA反转录成具有放射性的cDNA单链，然后与不表达目的基因的组织（简称-）提取的mRNA做过量杂交，在+、-组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA仍保持单链状态，通过仅吸附双链的羟基磷灰石柱除去cDNA/mRNA异源双链核酸分子，这样就可富集特殊细胞中差异表达的cDNA序列。,扣除杂交同样也可以用来分离缺失突变的基因,卵白素（avidin）是抗生物素蛋白的配体，是一种糖蛋白，与生物素的亲和力极高。但等电点偏碱（pI=10.5）,中性环境下带正电荷，易于和其它带负电荷的生物大分子非特异结合产生假阳性。链亲和素不是糖蛋白，等电点为中性，特异性较高。,第四节cDNA表达文库的功能筛选,一、蛋白质活性分析用于cDNA表达文库功能筛选有三种活性碱性蛋白的检测法。第一种方法是用一个真核的表达质粒文库，它可以在瞬时转染猴肾细胞（COS-7细胞）高水平地表达。第二种策略是用功能性探针筛选噬菌体表达文库，此和用抗体抗原结合来筛选cDNA表达文库非常相似。第三种策略是用定向克隆cDNA库作为一种手段在体外产生转录的RNA，再注入非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中，在体外分析蛋白质的功能。,用克隆的蛋白质通过蛋白质的相互作用来筛选cDNA表达文库的思路是来自S.Fields（1989）等的工作，最初他们用转录激活法在酵母中鉴别一种突变，这一突变中断了两个已知蛋白之间在体内的互作用。这种体内蛋白质的相互作用法便称为酵母双杂交筛选（yeasttwo-hybridscreen）。酵母双杂交策略的基础是早期M.Ptashne等发现的酵母GAL4转录因子，这是一种模块式蛋白（modularprotein）。,二、酵母双杂交系统,M.Ptashne实验室发现GAL4的转录调节活性需要一个序列特异的DNA结合功能域（BD）和一个转录激活功能域（AD）。依据这些GAL4蛋白功能域的模块性，Fields等设计了一个灵活的三个成分的系统在酵母中鉴别蛋白与蛋白间的相互作用。这三个必须的元件是：插入GAL4的BD基因和“饵”蛋白基因的表达载体；插入GAL4的AD基因和待测靶蛋白基因的表达载体；用于筛选GAL4的报道基因。当GAL4BD-AD蛋白复合体重构时可激活报道基因。,(二)酵母的双杂交系统(yeasttwo-hybridsistem),2ori,2ori,Camr,Camr,GAL4的BD功能区,GAL4的AD功能区,“饵”蛋白,靶蛋白,靶蛋白,“饵”蛋白,GAL4的BD,GAL4的AD,TPR1+,LEU2+,相互作用,共同转化酵母细胞,UAS,LacZ报道基因,靶蛋白载体,饵蛋白载体,RNA聚合酶,转录因子,反向双杂交系统的作用原理,反向双杂交系统的作用原理。（A）当杂交蛋白X和Y之间结合则可启动tetR转录。而TetR蛋白可抑制HIS3基因表达，导致细菌在缺乏组氨酸的培养基上“不生长”。当通过Y蛋白基因突变或消除X和Y之间的结合时，则终止tetR表达，消除了对HIS3的抑制，导致其表达，使细菌在选择培养基上得以生长。(B)反向双杂交系统还起到反向选择酵母报道基因的作用。URA3和CYH2对酵母细胞都是有毒害的。消除X与Y蛋白质互作就能使细胞在不具有这些毒物的培养基上生长。LexA是E.coli中参与SOS应答的基因之一。,三、cDNA噬菌体展示技术,酵母双杂交适合于鉴别蛋白之间的相互作用，但很多重要分子间相互作用是发生在蛋白质(如细胞表面受体)和和一种扩散性小分子(如配基)之间,酵母双杂交显得无能为力，对这一类受体蛋白cDNA文库的筛选1985年G.P.Smith等建立了一种方法，称为噬菌体展示(Phagedisplay)技术。这是一种对多肽功能的进行筛选的技术即将外源蛋白分子或多肽的基因插入到丝状噬菌体外壳蛋白质基因的信号肽后，与噬菌体外壳蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。,借助于固体基质上附着的抗体、受体、抗原或酶的底物等分子与靶分子的亲和力，经淘选(panning)可富集表达特异蛋白质的噬菌体。方法：(1)将随机的多肽DNA盒(randompeptideDNAcassette)插入到基因III的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面出现各种不同的蛋白质和多肽，此即是通常所说的多肽文库。(2)然后通过免疫吸附或亲和层析分离出特定的目标噬菌体。(3)扩增阳性噬菌体。(4)用ELISAs进行分析鉴定。,噬菌体展示技术的基本方法。固体基质上附着的抗体、受体、抗原或酶的底物等分子，通过靶分子与固相支持物上(如塑料盘)，的分子的亲和力，筛选出目的噬菌体,第五节用克隆cDNA作为反应物,cDNA序列的分离和分析仅是在众多不同研究目标的第一步，最终目标是确定一个编码基因产物的生物学功能。如获得了全长的开放可读框(ORF)，就能在培养细胞中用蛋白质表达系统开始研究该基因产物的生化结构，最终可进行基因寻靶(genetargeting)和将目的基因转入生物体中。甚至在未获得完整的基因转录物时，用cDNA片段也能研究各种基因的表达。,在这一节中将介绍用cDNA作为一个反应物来检测基因表达最常用的的三种方：RNA印迹；核酸酶保护法；核连缀转录试验。,一、RNA印迹,RNA印迹是利用毛细管作用将电泳分离的RNA带转移到尼龙膜或者硝酸纤维滤膜上。这种滤膜在促进形成cDNA-RNA异源双链的条件下，可用来和变性的cDNA探针杂交，然后用低离子强度的缓冲液连续的几次洗涤除去未杂交的探针，滤膜经过干燥后经过放射自显影或感光成像仪（phosphorimager）筛选来确定相关基因转录物的大小和丰度。通过RNA印迹也可用来分析因不同剪接而产生的不同大小的成熟RNA。,二、RNase保护性实验(RNaseProtectionAssay，RPA),RPA是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。核酸酶保护试验也是定位特殊位点连接的方便方法。原位分子杂交是用体外合成高度特异活性（同位素或非同位素的）反义RNA探针检测基因表达的另一种技术。在此方法中，RNA探针是和组织标本或用甲醛固定的完整标本进行杂交，此过程要在显微镜下镜检然后分析存在的阳性杂交信号。对此技术进行改进成为原位PCR（insituPCR）,二、RNase保护性实验(RNaseProtectionAssay,RPA),RPA是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。,三、核连缀转录分析（nuclearRun-onAssay）,为了确定RNA稳态水平的改变是否由于转录起始速率的增加或减少所致，需要能区分转录和转录后的实验方法。大部分直接的试验方法是通过报道基因来研究基因表达的转录控制。第二个方法是在分离的核中测定核“连缀”（run-on）转录物的数量。这个试验最初称为“核流出（nuclearrun-offs）”,但由于在体外合成转录物时模板DNA实际上并未“流出”，所以更为正确的名称是“核连缀转录分析”。,(-)生长因子,()生长因子,支气管上皮细胞,收获细胞，裂解、纯化细胞核,AMG基因,GAPDH基因,核膜,AMG(abnormalgametophytes)异常配子体基因,GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)甘油醛3-磷酸脱氢酶,加32P-UTP温度增加到30,纯化RNA并与cDNA进行斑点杂交,放射自显影,AMGcDNA,GAPDHcDNA,质粒DNA,核连缀转录分析用来测定RNA稳定水平是否发生改变，反映了在核中新开始的转录物数量增加。在这个例子中，核是分别来自培养的缺乏生长因子和存在生长因子的两类细胞中。结果显示假定的AMG基因RNA稳定水平增加了。通过在体外合成的32P-标记的RNA池，然后分别和点在滤膜上的变性的AMGcDMA及作为对照的GAPDH基因序列的进行斑点杂交。杂交探针RNA所用的量可以确定生长因子的处理增加了AMG基因转录的起始。非特异的RNA-DNA杂交可以用质粒载体作为对照来监控。,第六节实例3：体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因,一、研究目的一个学者分离了一个神经细胞系的突变体，它含有一个细胞内受体刺激信号传导途径中的一个遗传缺陷，其正常功能是使核膜孔上半胱氨酸蛋白酶（cysteineprotease）翻译后激活。他打算用一个体外表达克隆（IVEC）来鉴别cDNA克隆，这个cDNA克隆编码被刺激的突变体细胞中蛋白酶活化功能。这种生化互补方法是一种高通量筛选的筛选法，其原理是用96孔板荧光计在体外检测