7.免疫分析-1

1,第八章免疫分析(一),2,所谓免疫分析(Immunoassay)是指利用抗原(Antigen)与抗体(Antibody)之间高特异性的反应(即免疫反应)实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法。,3,竞争免疫分析示意图,将抗体(Ab)固定于一个固相载体上，然后抗原(Ag)与标记抗原(Ag*)竞争性地与固定化的抗体反应；,将未反应的抗原(通常是被分析的对象)及标记抗原洗去；,检测标记抗原的量，其浓度的大小与待测抗原的量成反比。根据标记物的不同可分为放射免疫分析和非放射免疫分析两大类。,4,8.1.抗原、抗体及其反应,抗原和抗体的性质及它们间的反应是建立免疫分析的基础。虽然从表面上看它们之间的反应与一般的化学反应很相似，但在实际应用时要比一般的试剂分析复杂得多。只有对它们的性质有了很好的了解,才能建立一种真正有效的分析方法。,5,8.1.1抗原在免疫分析中抗原往往作为被分析的对象出现，对它的了解包括与抗体制备相关的性质及抗原标记两个方面。,6,基本概念能引起动物机体特异性免疫应答的化学物质叫抗原(Antigen,Ag)，通过这种免疫应答所产生的，能够与抗原发生特异性反应的蛋白质就是抗体(Antibody,Ab)。抗原具有免疫原性(Immunogenicity)和抗原性(Antigenicity)两种特性。,7,免疫原性是指引起免疫应答的性质，而抗原性则是指与抗体反应的性质，两者并不一致。具有免疫原性的物质必然有抗原性，反之则不一定成立，如半抗原(Hapten)，它具有抗原性，但不具备免疫原性。,8,半抗原是指那些不能引起免疫应答，却能与抗体反应的一类小分子，它们相当于抗原分子上的一个抗原决定簇(Determinant)，即抗原分子上与抗体结合的一个区域。一般来说，抗原并没有明显的结构特征使之与非抗原化学物质得以区别，所以关键要看它是否能引发免疫应答。,9,抗原性的化学基础抗原性与抗原的化学结构有着密不可分的关系，它不仅与高特异性、高亲和性抗体的制备相关，而且与免疫分析中标记抗原的设计有关，尤其是对与半抗原相关的分析体系更是如此。,10,抗血清对半抗原及其类似物反应的特异性研究示意图,11,抗血清与抗原及其类似物沉淀反应的情况(沉淀量),注：符号“”代表有沉淀，“”代表未观察到沉淀，“”代表有沉淀和没有沉淀之间,12,免疫原性的化学基础化合物免疫原性的化学基础并不像抗原性的化学基础那样清楚，但发现它也与其结构紧密相关。抗原的一些特征如下：(1)抗原对免疫对象来说是外来物质，也就是说，抗原的结构要新异，要使生物体能够识别它是非己的，这样才能有效地刺激免疫系统产生免疫应答，即具有免疫原性。例如，兔子可以对人血清白蛋白产生免疫应答，但不会对兔血清白蛋白产生免疫应答。,13,(2)抗原一般都是一个复杂的大分子，其分子量一般大于5000，这里复杂不仅指要有比较大的分子量，而且在组成及立体化学结构上也要具有复杂性，而不是一个简单的聚合物，如尼龙、聚苯乙烯及聚丙烯酰胺它们的分子量虽然都很大，但不具有免疫原性。,关于分子大小的要求这一点并不绝对，如人们已发现砷酸、酪氨酸、赖氨酸取代的2，4二硝基苯及胰岛素(分子量约为1500)等小分子量的化合物也具有免疫原性。,14,(3)抗原的免疫原性还与免疫原的分子表层基团有关，对蛋白质抗原。它还与氨基酸的组成相关。例如，多聚赖氨酸无免疫原性，在其外层接上一层丙氨酸或甘氨酸，它仍无免疫原性，但若外层接的是酪氨酸，则它会表现出免疫原性由此可见，带芳香环氨基酸，或者说结构较为复杂的氨基酸对免疫原性有重要的贡献。,15,8.1.2抗体抗体是一类统称为免疫球蛋白(Immunoglobulin，简写为Ig)的蛋白质。是机体免疫力的一类重要物质基础，也是医学中用于疾病诊断、治疗、预防和研究发病机理的极为重要的试剂及制剂。抗体的性能对免疫分析是至关重要的。,16,Porter，1962,IgG分子的基本结构,17,免疫球蛋白是具有抗体活性的一类蛋白质，目前被人们所认识的免疫球蛋白可分为IgG、1gM、IgA、IgI)和IgE五种类型，分别称作免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、。用免疫学方法研究表明，这五种类型免疫球蛋白的主要区别在于重链序列的不同但链的长度基本相同。轻链的变化要相对小一些，只有和两种类型的链。虽然所有的抗体都是免疫球蛋白，但也有一些免疫球蛋白不具备抗体的活性。五种免疫球蛋白的主要功能也各不相同。,18,五种免疫球蛋白的比较,19,抗体的制备多克隆抗体：从特定的抗原免疫动物中提取的含有抗体的血清称之为抗血清。在许多分析应用中并不需要把抗体从血清中分离出来。这种抗血清会因不同动物，甚至是同种动物的不同的个体由于遗传性的差异，而导致所得抗体并非均一物质，特别是抗体的特异性及亲和力几乎每批产品都不相同，通常称这类抗体为多克隆抗体。,单克隆抗体：因为抗体由B细胞所产生，设法将单个B细胞分离出来加以大量的增殖形成群落，即克隆这些B细胞将产生结构相同、功能均一的抗体，称之为单克隆抗体。,20,抗体产生的细胞学,免疫应答中最主要的细胞是B淋巴细胞，它是抗体生成细胞，它在身体的各个部位均可以找到，但它主要存在于骨髓、脾脏和淋巴腺等部位。与免疫应答相关的另一类重要的细胞是T淋巴细胞，它是依赖于胸腺的淋巴细胞。,21,22,免疫应答的动力学,当抗原引入动物的有关组织时最初引起淋巴细胞的分化，特别是在淋巴结和脾脏中的淋巴细胞。然后，一种称之为浆细胞的抗体生成细胞便会增加。在注射入抗原和在血清中发现抗体之间存在一个潜伏期，之后抗体的浓度增加到最大，而后开始降低。如果抗原对动物是全新的，动物则表现出慢的响应(初次应答)但若动物以前遇到过这种抗原，则会出现二次应答。与初次应答相比，二次应答的速度快，而且没有潜伏期，抗体存在的时间长。抗体生成的动力学依赖于抗原及动物的种类，但初次免疫与再次免疫相应动力学之间的关系是特征的。,23,初次应答,二次应答,分泌Ig,免疫记忆,抗原,抗原,免疫应答的动力学示意图,分泌抗体的量,24,多克隆抗体的制备生产多克降抗体一般比单克隆抗体更实用一些。它的生产相对比较便宜、快速，也不需要特殊的技术或太长的时间。抗血清水平可以采用酶联吸附免疫分析(ELISA)法进行定量检测，也可以用免疫扩散、免疫电泳或免疫组织化学法进行定性的检测。如果免疫应答很成功，则可采集抗血清，并采用多种方法对抗体进行纯化，如沉淀及亲和色谱法。一般从520m1抗血清中可以得到毫克级的纯化抗体。,25,单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备是一项周期长、高度连续的实验技术涉及大量的细胞培养、免疫化学和细胞免疫学方法。其中包括两种亲本细胞的选择和制备，细胞融合、杂交瘤细胞的选择性培养、杂交瘤细胞的克隆化、单克隆抗体的制备、纯化及特性鉴定等。,26,27,抗体的纯化有多种方法可用来纯化多克隆和单克隆抗体。选择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求、及抗体的种类和来源有关，如抗体可以来源于血清，培养上清液或腹水。,28,8.1.3抗原与抗体的反应,抗体可以与抗原或半抗原以非共价键的方式结合这种作用类似于蛋白质和细胞表面受体或酶与其底物之间的相互作用，二者之间的相互适应性可以形象地用锁与钥匙之间的关系来比喻。因此，抗原与抗体的反应是一种可逆反应，反应的动力包括离子键、氢键、疏水力及范德华力。所有这些作用力都要求抗原和抗体相距很近。所以。某一抗原决定簇和抗体结合位点之间的良好结合，决定了抗原与抗体反应所形成的复合物的稳定性及特异性。,29,抗体与抗原反应的位点及价态抗原与抗体的结合位点是由抗体重链和轻链的超变区所组成的，所谓抗体与抗原反应的价态指可以与一个抗体分子反应的抗原的数目。除IgD的价态尚不清楚，IgM的价态为5价(理论上为10价)外，其余种类的免疫球蛋白的价态均为2价。,30,免疫沉淀反应由于抗体是二价的，一般的抗原又是多价的。因此，可以预计它们之间发生反应时将发生交联。对半抗原来说通常只有一个抗体结合部位，所以不会发生大量的交联。抗原与抗体反应时一般形成晶格型结构。如果这种结构足够大的话，它将会沉积下来，这种沉积作用可以用某种方法来观测。如果抗原原来是可溶性的，则这种作用就称之为沉淀作用。,31,比例性示意图,抗体过量,比例合适,抗原的量,抗原过量,前带,等价带,后带,沉淀量,32,8.2免疫分析中的分离方法,如何建立一个免疫分析方法，质量作用定律是其基础。它要求：(1)抗原是单一的化学物质。事实上，一个标记的抗原与其未标记的抗原就往往有所不同；(2)抗体也应是均一的；(3)抗原和抗体均应是单价的；在一般情况下是做不到的(4)抗原与抗体间的反应要达到平衡状态，其微观上是可逆的；(5)结合相或游离相的测定必须准确，而且不受分离不完全或非特异性吸附的影响。,上述条件一般很难都满足,33,8.2.1免疫分析对分离技术的要求,(1)一个完美的分离方法应该使游离的与结合的抗原或抗体充分地分离，而又不影响抗体与抗原反应所形成的免疫复合物的稳定性，并且对反应介质的组成呈惰性。(2)分离技术不影响到抗原与其抗体间的反应。由于免疫分析的对象常常是复杂的生物样品如全血、血浆、血清和尿液等等，所以，分离技术应不受这些样品中其它物质的干扰。除了上述考虑之外，任何一种分离方法都应简单、快速、耗费低、易于自动化，并且适用于较多的分析对象。,34,8.2.2分离方法的分类,免疫分析中常用的分离方法,35,二抗,抗动物种的二抗是在20世纪70年代末80年代初开始使用的，二抗是专门针对-球蛋白的一种抗体，也称为抗抗体。二抗的使用，使免疫分析得到了巨大的进步。,通过二抗上结合不同的特异基团或蛋白，如荧光试剂、辣根过氧化酶等，可以很方便地实现对一抗结合对象进行分析。,36,固相免疫分离,将抗体固定在固相载体上，使特异性分析对象被抗体吸附后得到与其他干扰物质分离。,常用固相载体,37,抗原、抗体的固相化,不论是抗原还是抗体均可固相化并且均已被用于非均相免疫分析。固相化方法很多，包括简单的非共价吸附和共价偶联方式。吸附法基于塑料表面对蛋白质的吸附性能。这种方法的缺点是缺乏重现性。共价偶联才是可靠的固定连接方法。,将免疫试剂固相化以后可以使其稳定性提高。例如，当抗体固相化于乳胶上以液态试剂保存时可稳定一年以上；而将固相干燥后几乎可永久保存。很显然，非共价固相化的抗体不如共价偶联的抗体耐解吸。总之，偶联的方式应小心选择，以免对抗体的活性有影响。,38,洗涤免疫分析的对象常常是复杂的生物样品，因此，优化免疫反应和选择合适洗涤缓冲液，以降低生物基质的非特异性吸附便成为建立免疫分析方法过程中一个非常关键的问题。如洗涤剂中常含有缓冲盐类、蛋白质(如BSA)及去垢剂(如吐温20)等。,39,8.3酶免疫分析,酶免疫分析(enzymeimmunoassay,EIA)代表了这样一类免疫分析方法，它利用酶催化底物的反应以产生有色的、发光的或荧光的产物而被检测。是当前应用最广泛的免疫检测方法。EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)、酶免疫试验法(Enzyme-monitoredImmunotest,EMIT)、竞争结合酶免疫分析法(CompetitiveBindingEnzymeImmunosorbentAssay,EIA)和免疫酶分析法(ImmunoenzymometricAssay,IEMA)。,40,酶免疫分析法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。,41,常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horser