皮肤科细胞培养及临床应用

皮肤病学相关研究中所涉及的细胞培养问题,中国医学科学院皮肤病研究所李新宇2004年2月,2018/1/25,1,细胞培养涉及的基本知识,2018/1/25,2,最常见的两种生长型细胞,贴壁依赖性细胞(Anchorage-dependent cells) 贴附于不起化学作用的物质(玻璃、或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持。悬浮培养细胞(Suspension culture) 细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。,2018/1/25,3,细胞培养中常用的几个术语,细胞系(Cell line)： 原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。 连续传代 连续传代 连续细胞系 有限细胞系 (已建成的细胞系),2018/1/25,4,细胞株(Cell strain): 由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系。细胞周期(Cell cycle) 细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。 4个时期：S期：DNA合成期 M期：有丝分裂期 G1期：有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期 G2期：DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期 G0期：某种原因导致细胞不再沿周期进行，进入 休眠状态,2018/1/25,5,细胞一代时间(Cell generation time) 单个细胞两次连续分裂的时间间隔。群体倍增时间(Population doubling time) 在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所 需要的时间。,2018/1/25,6,克隆(Clone) 单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。细胞融合(Cell fusion) 体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞(Hybrid)。细胞汇合(Confluence) 器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层。,2018/1/25,7,原代培养(Primary culture) 从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的 培养。传代培养(Passage)(Subculture) 细胞从一个培养器皿转移至另一个培养器皿 中培养。再培养(Reculture) 单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基 中的过程。,2018/1/25,8,集落形成率(Plating efficiency) 细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百分率。 单个细胞 集落 克隆形成率(Cloningefficiency)群体密度(Population density) 培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数(细 胞数/cm2)。饱和密度(Saturation density) 特定条件下，培养器皿中能达到的最高细胞数 (细胞数/cm2或细胞数/cm3)。,2018/1/25,9,培养基,培养基 天然培养基 合成培养基 基本培养基(通用培养基)(MEM ) 无血清培养基 无蛋白培养基 血清基本培养基(通用培养基) 完全培养基,2018/1/25,10,基本培养基的组分 四大类物质 无机盐 氨基酸 维生素 碳水化合物 pH指示剂 酚红,2018/1/25,11,常用基本培养基 RPMI 1640 应用最广泛 DMEM 高糖型 4500g/L 葡萄糖， 低糖型 1000g/L葡萄糖 HamF12 无血清培养基常用的基础培养 基 199 ,2018/1/25,12,培养基的选择 培养细胞的首选培养基 常用培养基 根据细胞株特点、实验需要选择 用生长曲线、集落形成率等指标选择,2018/1/25,13,培养基配制时的注意事项 严格按说明书要求添加必要成分 NaHCO3 谷氨酰胺 HEPES - 各成分顺序溶解 配制培养基用水、器皿 灭菌 分装、保存,2018/1/25,14,培养基添加成分 NaHCO3 一般按说明书要求添加 封闭式培养用5.6%或7.4%液调节 谷氨酰胺 易降解，使用前添加 使用终浓度0.002mol/L HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸) 主要作用为防止培养基pH迅速变动 使用终浓度0.01- 0.015mol/L,2018/1/25,15,完全培养基的添加成分,牛血清 小牛血清：取自出生1030天的小牛。 新生牛血清：取自出生24小时之内的新生牛。 胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿刺方 法获得。,2018/1/25,16,血清的主要作用 提供细胞生长所需的基本营养物质。 (激素、生长因子、结合蛋白) 提供贴壁和扩展因子 (纤连蛋白,层粘连蛋白)。 对培养中的细胞提供保护作用。 抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作用 终止贴壁细胞消化传代中所用胰蛋白酶的作用 血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所受的机 械损伤,2018/1/25,17,使用血清的缺点 改变细胞在体内的正常状态 促进某些细胞生长同时抑制另一类细胞生长。 所含物质对细胞生长的影响或毒性作用 批间成分的一致性 支原体、病毒的潜在污染性,2018/1/25,18,血清质量的判断 质量鉴定报告 理化性质 微生物检测 促生长效果(培养细胞检测) 克隆形成率、贴壁率测定 连续传代培养 外观判断 透明清亮 土黄色或棕黄色 无沉淀或及少量沉淀 较粘稠,2018/1/25,19,血清的使用与贮存 灭活处理: 56水浴, 30分钟(去除补体) 贮存条件: 分装 -20 长期贮存, 避免反复冻融 4 , 140 代)。,2018/1/25,54,三. 细胞培养技术在皮肤病相关领域中的应用,2018/1/25,55,微载体培养 细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。 特点 不增加培养容器表面积或培养基容积的前提下 提高培养表面积。 省却了容器等的清洗和准备工作。 细胞与培养液的分离简单。 减少繁复的操作步骤,降低污染率。 提高产率。 微载体制作材料的进展 葡聚糖 纤维素 聚乙烯和二氧化硅, 聚苯乙烯 明胶,2018/1/25,56,在化妆品功效研究中的应用,传统皮肤细胞培养方法的应用 单层的培养技术-皮肤组织获取和化妆品研发 培养黑素细胞-美白化妆品活性成分筛选 朗格罕细胞、和淋巴细胞共同培养 -体外筛选化妆品过敏作用 富含Merkel细胞的表皮细胞悬液培养 -局部应用药物的耐受机制研究,2018/1/25,57,成纤维细胞的培养 -抗衰老化妆品活性成分开发中应用(筛选中 草药有效成分的抗衰老活性) -化妆品生理功效研究中应用,2018/1/25,58,皮肤细胞的“三维培养” 器官型培养(气-液体交界面培养) 分离、培养皮肤的,使其在体外扩增, 然后将其接种于真皮类似物上, 暴露于空气中, 使表皮正常分化, 形成类似天然表皮的复层组织(体外重建表皮)。 真皮类似物 去表皮真皮 胶原基质 惰性材料 应用 真皮类似物和重建表皮的组合形成具有表皮和真皮 的简化的人皮肤。 用成纤维细胞研究从表皮透过的化妆品活性物质的 生物学效应,了解表、真皮之间的相互作用。 将其他细胞(内皮细胞、白细胞)引入真皮类似层,扩大测试系统 的使用范围。,2018/1/25,59,皮肤器官培养 活体皮肤于体外培养，并使其保持其一定的结构和功能 。 培养方法 液体浸没的皮肤器官培养 气-液面交界的皮肤器官培养 应用 化妆品对皮肤急性刺激毒性研究,2018/1/25,60,在化妆品研发中的应用 延缓皮肤衰老化妆品 以皮肤和成纤维细胞为受试对象,寻找或筛 选具有抗衰老活性物质 ,确定该物质基本毒性情 况。 (观察对两种细胞增殖能力及活性的影响) 研究外界因素对皮肤的药理学或毒理学作用。 (如、药物及化妆品等) 将损伤作用作为模型进行化妆品的干预研究,2018/1/25,61,皮肤美白产品 将活的黑色素细胞引入重建真皮类似环境，作为体外皮肤美白剂的初筛模型。 光生物学研究, 如防晒剂的效果评价。,2018/1/25,62,化妆品配方及成品的毒理学研究 单层皮肤细胞培养 外来化学物的代谢及最初的刺激和过敏 反应。 皮肤三维培养 化妆品的细胞毒性、有效性研究及局部 应用化合物(药用化妆品、表面活性剂、渗 透剂和杀菌剂等)效果评价。,2018/1/25,63,毛发用化妆品 以毛根鞘上皮细胞为对象, 进行护发活性物质的筛选以及毛发用化妆品毒性测试研究。,2018/1/25,64,基础研究 皮肤三维培养(重建表皮、真皮类似物) -化妆品和洗护发产品对人体皮肤的刺激性 研究 -重建表皮可用于研究表皮终末分化以及研 究表皮细胞分化调节物、表皮对刺激反应 机制；化妆品经皮吸收和化妆品对屏障功 能的保护作用 -真皮类似物用来研究真皮层的组成及生理 功能 -重建表皮+真皮类似物共培养系统用来研究 皮肤生理代谢、化合物的光毒性、效 应和防晒剂的作用,2018/1/25,65,体外细胞培养模型 角质形成细胞 黑色素细胞 朗罕氏细胞 成纤维细胞 皮脂细胞,2018/1/25,66,细胞培养评估方法及指标 评估目的 细胞模型 评估指标 毒性 2,3-细胞培养 细胞形态, 细胞活性 (中性红MTT,LDH,PEG2) 美白 黑素细胞培养 黑素的生成 黑素细胞和 酪氨到酶活性 角朊细胞共培养 3-细胞培养 抗衰老 成纤维细胞培养 细胞增殖, 胶原蛋白, 角朊细胞培养 弹性蛋白, 3-细胞培养 粘多糖等的生成,2018/1/25,67,在基因工程药物血药浓度测定中的应用,特定依赖细胞株培养法 以药物对特定依赖细胞的增殖或抑制、细 胞数目的增减为量效指标。 细胞增殖法 : 促进特定依赖细胞株增殖, 抑制增殖法: 抑制细胞增殖,2018/1/25,68,细胞培养量效指标的测定方法 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(3H-TdR) 59Fe核素标记法 四氮唑盐法(MTT) 直接计数法 其他间接法,2018/1/25,69,细胞毒性的观察方法 放射性同位素摄入法 3H-胸腺嘧啶- 3H-亮氨酸-培养基中掺入3H-亮氨酸，根据 3H-亮 氨酸在细胞内含量测定细胞内蛋白质合 成情况 。 同位素法特点 揭示细胞分子水平的动态变化,是研究细胞代谢 状态的重要手段。 放射性损害。 需要特殊实验室和特殊设备。 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法),2018/1/25,70,荧光染色法 乙酰乙酸荧光素法 当细胞受到损伤时,细胞膜的选择通透性 屏障作用消失,利用乙酰乙酸荧光素和溴化 乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在 荧光显微镜下迅速区分受损细胞。,2018/1/25,71,发光细胞活力测试 采用一种独特的、稳定性荧光素酶来检测有活力 细胞。荧光素酶利用荧光素、氧和ATP作为反应底 物，产生氧化荧光 素，并以光的形式释放能量。由 于荧光素酶反应需要ATP，因而反应产生光的总量 和反映有活力细胞数的ATP总量呈正比。产生的发 光信号和培养基中的有活力细胞数呈正比。 特点 适用于高通量应用，测试大批量样品可快速得到 结果。需要特殊的发光仪或CCD相机读取发光信号。,2018/1/25,72,流式细胞光度术(FCM 法) 利用鞘流原理,使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单 列,按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光,检测 器可逐个对细胞的荧光强度进行测定。 特点 对细胞测定能力为30-60万个细胞/分钟,同时可对细 胞的核酸,蛋白质酶、细胞周期分布等八种参数进行 测定。,2018/1/25,73,在药物开发中的应用,药物筛选模型 整体动物水平 组织器官水平 细胞分子水平细胞分子水平药物筛选模型 细胞系的生物学特征较为一致，用于观察药物对细胞形态及生理特征的影响，判断药物疗效及其毒性。 材料用量少，药物作用机制较明确，实现大规模筛选，缩短新药筛选周期。,2018/1/25,74,模型优势 大样本量的筛选(扩大筛选对象和范围)。 一药多筛(样品量少，珍贵药物多模型筛选， 扩大新药范围)。 高通量药物筛选(HTS) 计算机控制的自动化大规模筛选体系。利用细胞