My动物细胞工程

第三节动物细胞工程,动物细胞与组织培养,从病人关节软骨中未受力的部分，取出一片约为葡萄干大小的健康软骨组织；分离软骨细胞并经三星期的体外培养，使细胞数增加约1020倍；清理软骨受损的部分，从下方骨头部位取出一片约与伤口大小相同的骨膜，缝在伤口上方，再将软骨细胞注射到骨膜下方；经过复健一年后即可恢复正常的生活。,动物细胞与组织培养是指在体外模拟动物体内环境，将动物细胞或组织在无菌、温度适宜和营养充足的条件下培养，使其继续生长、繁殖并维持原有结构和功能的技术过程。,动物细胞与组织培养,大规模地生产有重要价值的生物制品：如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。为基因工程技术提供受体细胞：如培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植等。对有毒物质的检测：许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手段。细胞的生理、药理和病理研究方面：如抗癌药物的筛选，治疗和预防癌症及其他疾病等。,动物细胞培养技术的应用,1.动物细胞培养的条件:,适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4。,液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。,“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。,对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。,2培养过程,(1)原代培养材料：动物早期胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，因为这些组织或器官中的细胞生命力旺盛，分裂能力强。过程：直接从动物体内取出的组织块，用胰蛋白酶使其分散成单个细胞，然后转入培养瓶中进行培养的过程。(2)传代培养原代培养到一定程度，空间会变小，营养会减少，而且细胞会出现接触抑制，如果还需要继续进行细胞培养，就要用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，重新形成悬浮细胞，分装到多个培养瓶中继续培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,（1）在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。,相互接触,接触抑制,单层（或一层）,胰蛋白酶,3.回答下列有关动物细胞培养的问题：,（2）胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,注意时间的控制,（3）随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性降低,细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量。,衰老甚至死亡,不死性,减少,【小结】动物细胞培养与植物组织培养的比较,思考与探究,动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,(2009年高考江苏卷)动物器官的体外培养技术对于研究器官的生理、病理过程及其机制意义重大。下图是一个新生小鼠的肝脏小块培养装置示意图。请回答下列问题：,(1)肝脏切成小薄片，这有利于肝脏细胞_。(2)气室中充入5%CO2气体的主要作用是_。(3)培养液中添加抗生素是为了抑制细菌生长，但要注意选择抗生素的_，以保证抗生素对肝脏无害。,吸收氧气和营养物质、排出代谢废物,维持培养液适宜的pH,种类和剂量,(4)有机物X有毒性，可诱发染色体断裂。利用上图所示装置和提供的下列材料用具，探究肝脏小块对有机物X是否具有解毒作用。材料用具：肝脏小块，外周血淋巴细胞，淋巴细胞培养液，植物凝集素(刺激淋巴细胞分裂)，显微镜，载玻片，盖玻片，玻璃皿，滴管，吉姆萨染液(使染色体着色)，有机物X溶液等。,实验过程：在淋巴细胞培养液中加入植物凝集素培养淋巴细胞，取4等份，备用。利用甲、乙、丙、丁4组上图所示装置，按下表步骤操作(“”表示已完成的步骤)。,上表中还需进行的操作是_。,向乙(或丁)组装置中放置肝脏小块,培养一段时间后，取4组装置中的等量培养液，分别添加到4份备用的淋巴细胞培养液中继续培养。一段时间后取淋巴细胞分别染色、制片。在显微镜下观察_，并对比分析。若丙组淋巴细胞出现异常，而甲组的淋巴细胞正常，则说明_。,染色体形态和数量,肝脏小块对有机物X具有解毒作用,跟踪训练右图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：(1)容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自_。(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是_，然后用_处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是_。(3)培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有_等。在此瓶中的培养称为_。,(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用胰蛋白酶处理，然后配制成_，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是_。,答案：(1)早期胚胎或幼龄动物的器官或组织(2)剪碎组织胰蛋白酶使细胞与培养液充分接触(3)葡萄糖、氨基酸、无机盐和动物血清原代培养(4)细胞悬浮液(5)细胞没有发生癌变,细胞核移植与动物体细胞克隆,在保护濒危物种；加速家畜遗传改良的进程；生产医用蛋白质及组织器官的移植；了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病等方面发挥重大作用！,动物体细胞克隆是将供体体细胞的细胞核与受体去核卵细胞的细胞质进行人工组合，借助于卵细胞的发育能力，经过培养发育成胚胎进而形成个体的技术。其技术关键是细胞核移植技术。,原理：细胞核的全能性。动物细胞全能性的特点动物细胞的全能性随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到抑制，全能性表达很难，但动物的细胞核内仍含有该种动物的全部遗传基因，具有发育成完整个体的潜能，即动物的细胞核仍具有全能性。细胞核全能性表达的条件不能只靠动物的细胞核，必须提供促进细胞核表达全能性的物质和营养条件，才能保证细胞核全能性的表达，去核的卵母细胞是最合适的细胞，因为卵母细胞体积大、易操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,1、成功率比较低2、大多存在健康问题3、克隆动物食品安全问题,体细胞核移植技术存在的问题：,用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,【特别提醒】动物细胞克隆利用的技术主要包括动物体细胞核移植技术、动物细胞培养技术和胚胎移植。动物体细胞核移植产生的新个体的亲本有三个：体细胞核供体、卵细胞细胞质供体、代孕母体。新个体细胞核基因型与体细胞核供体完全一样，因此新个体性状与体细胞核供体基本相同。卵细胞细胞质中也有少量DNA，即线粒体DNA，新个体性状与卵细胞供体也有一些地方相同。代孕母体没有为新个体提供遗传物质，性状之间没有联系。克隆可分以下三个层次：a.分子水平：如DNA复制；b.细胞水平：动物细胞培养；c.个体水平：“多利”羊的诞生。,细胞核移植是一种利用显微操作技术将某种动物的细胞核移入同种或异种动物的去除细胞核的成熟卵细胞（一般采用M中期卵母细胞）内的技术。,用卵母细胞作受体细胞的原因：卵母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。处于减中期的卵母细胞具备受精能力,细胞质中合成与分裂分化有关的物质能刺激融合后重组细胞进行分裂分化,形成重组胚胎。卵母细胞体积大，便于操作。卵黄多，营养物质丰富。,易错分析对克隆与组织培养、试管动物(婴儿)区分不清,“治疗性克隆”将是人胚胎干细胞(简称ES细胞)造福于人类的一种非常重要的途径。应用人胚胎干细胞进行“治疗性克隆”研究的技术途径包括以下几个步骤：首先取病人的体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞中；在早期胚胎形成后，从中分离获得ES细胞；对ES细胞进行基因修饰和定向分化研究，将定向分化后的细胞移植给病人。进行核移植的目的并不是用于克隆人，而是希望通过对ES细胞进行分离培养、定向分化等处理后，进一步获得再造的人体组织或器官。请根据材料回答下列问题：,(1)人类“治疗性克隆”属于动物细胞工程的_技术。(2)科学家为何要将患者的体细胞核植入去核的卵细胞中，而不直接用体细胞进行细胞培养？_。(3)“治疗性克隆”的结果说明高度分化的体细胞的细胞核仍然具有_。相同的胚胎干细胞，“克隆”的结果各种各样，如有的是胰岛细胞、有的是血细胞、有的是心肌细胞，究其本质原因是基因_的结果。(4)克隆的器官在给自身移植方面的主要优点是_。(5)目前世界上绝大多数国家反对进行“克隆人”的原因是_。,动物细胞核移植,体细胞核在体细胞中不能表达全能性，而卵细胞的细胞质可以为其提供表达全能性的环境,全能性,选择性表达,没有免疫排斥反应,克隆人会导致人类社会的伦理道德发生混乱,细胞融合和单克隆抗体,1动物细胞融合(1)概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。(2)过程：细胞融合的过程包括细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合。细胞膜融合是细胞融合的先导。没有细胞膜的融合，就不会有细胞质和细胞核的融合。(3)意义：克服了远源杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。(4)诱导方法：物理和化学方法与植物体细胞杂交相同，如聚乙二醇、电激法等，又增加了生物方法：灭活的病毒。,两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的,不同DNA的两个细胞,灭活的病毒,融合,有丝分裂,两个完整的杂交细胞,为什么灭活的病毒能作为诱导剂？不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。,2单克隆抗体,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,现在，科学家借助于动物细胞融合技术可以获得特异性强、灵敏度高、产量大单克隆抗体。并利用单克隆抗体作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并与一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其他疾病。制备条件：无菌、无毒的环境、营养全面、适宜的温度和pH、气体条件符合要求。,单克隆抗体是由单个B细胞克隆形成的细胞群产生化学性质单一、特异性强的抗体。,传统获得抗体的方法是先把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。缺点：产量低，纯度低，特异性差。,在动物发生免疫反应的过程中，体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。如何大量生产单克隆抗体？,利用B淋巴细胞产生抗体的功能。利用肿瘤细胞无限增殖的特性。利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。,如何大量生产单克隆抗体？,生产单克隆抗体的一般过程：,【特别提醒】从小鼠或其他动物体中取B淋巴细胞前必须先注射抗原，使体内发生免疫反应，而且参与融合的细胞应是浆细胞(只有浆细胞能产生抗体)或已免疫过的B淋巴细胞，不能简单地说B淋巴细胞。融合过程中一共有五种细胞(一般只考虑了细胞两两融合)，未融合的有两种，已融合的有三种，符合要求的只有杂交瘤细胞。两次筛选：第一次利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次是筛选出能分泌特定抗体的杂交瘤细胞。,整个制备过程为何要经过两次筛选？,第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），在特定的选择性培养基上,未融合的亲本细胞(浆细胞和骨髓瘤细胞)和融合的具有同种核的细胞(BB融合细胞、瘤瘤融合细胞)都会死亡,只有融合的杂种细胞(杂交瘤细胞)才能生长。这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖,又能产生单一的特异性抗体。,第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,1.为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？,小鼠骨髓瘤细胞可以在体外培养条件下大量增殖，B淋巴细胞能够产生抗体，细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。,2.骨髓瘤细胞是癌细胞吗？,有无限增殖能力（失去凋亡机制，失去接触抑制等）的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以说，瘤细胞不能等于癌细胞。,问题解释,3.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用是单克隆抗体的制备，而动物体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，还有就是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,4.鼠的单克隆抗体能否用于人体疾病的治疗？试分析？,不能。因为抗体具有特异性，鼠的B淋巴细胞所产生的抗体与人体B淋巴细胞产生的抗体是不同的。,植物体细胞杂交和单克隆抗体的制备的比较,利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经PEG诱导融合后的细胞均为杂交瘤细胞D.利用该单克隆抗体与SARS病毒核衣壳蛋白特异性结合的方法可诊断出病毒感染者,4.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的B淋巴细胞。,(1).该实验方案的目的是：_,(2).该方案能达到预期效果吗？为什么？,(3).A是从小鼠的脾脏中取得_该细胞能够产生_。,(4).图中B为_过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能_,又能_。,(5).C过程指细胞培养，该过程包括_培养和_培养两个阶段，其中_代以内的的细胞属于细胞株。,B淋巴细胞,抗体,细胞融合,灭活的病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,近年来，我国死于狂犬病的人数有上升之势。狂犬病病毒的核酸是RNA，机体感染病毒后产生的特异性IgG抗体，能消除狂犬病病毒，这是接触狂犬病病毒后及时注射疫苗和特异性抗体的重要依据。我国利用地鼠的肾细胞培养狂犬病疫苗，已取得良好效果。请根据上述材料，回答下列问题：(1)狂犬病病毒的毒力可发生变异。从自然感染动物体内分离的病毒株称为野毒株，其致病力强。将野毒株在家兔脑_内连续传50代后，变成固定毒株。固定毒株对人及动物致病。(2)特异性抗体获取的方法可用单克隆抗体制备法。在制备单克隆抗体的过程中，应用的动物细胞工程技术是_。,(3)如图是单克隆抗体制备过程示意图，请据图回答：,图中A过程，从小鼠的脾脏中取得的“小鼠细胞”是_细胞，该细胞能够产生_。从小鼠体内提取分离该细胞之前，给小鼠注射的特定的物质是_。图中B过程是细胞融合，该过程需要用灭活的_、聚乙二醇或电激等诱导。特异性抗体的获取方法也可以采用向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。与这种方法制备的抗体相比，单克隆抗体具有_等特点。(4)动物细胞体外培养需要满足的环境条件有_。(5)单克隆抗体技术还有哪些用途？_。,答案：(1)活细胞(2)动物细胞融合技术(3)B淋巴抗体抗原(或狂犬病病毒)病毒(或仙台病毒)特异性强、灵敏度高，并可以大量制备(4)无菌、无毒，温度和pH，气体，营养物质(5)作为诊断试剂；开发治疗恶性肿瘤的抗体等,2009山东理综,35人类在预防与诊疗传染性疾病过程中,经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒,该病毒表面的A蛋白为主要抗原,其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：,请回答：(1)过程代表的是。(2)过程构建A基因表达载体时,必须使用和两种工具酶。(3)过程采用的实验技术是,获得的X是。(4)对健康人进行该传染病免疫预防时,可选用图中基因工程生产的所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时,可从疑似患者体内分离病毒,与已知病毒进行比较;或用图中的进行特异性结合检测。,答案(1)逆(反)转录(2)限制性核酸内切酶(限制酶)DNA连接酶(两空可以互换)(3)细胞融合杂交瘤细胞(4)A蛋白核酸(基因)序列抗A蛋白的单克隆抗体,2007年诺贝尔生理学或医学奖分别授予美国人马里奥卡佩基、奥利弗史密斯和英国人马丁埃文斯。3位科学家的获奖原因是其研究为“基因靶向”技术的发展奠