受体研究方法

受体概论之,受体研究方法,2,二、受体研究的内容,* 受体与配基的相互作用；* 受体的激活机制；* 后 续信号转导的启动机制；* 信号转导的路径；* 引起相应的生物学效应。,3,三、受体与配基结合反应的基本特征,*可饱和性 细胞特定的受体，数量有限。*可逆性 内 解离；外 可逆和不可逆*特异性和亲和力 配基、组织或器官特异*和生物学效应相关,4,四、受体研究的意义,* 受体是调节细胞功能的有高度特异性的“门户”，而细胞功能的改变是乃许多疾病的基础，因此研究受体结构功能的改变和各种重要疾病发病机制的关系受到高度重视；,5,* 寻找有高度选择性的药物一直是科学家的追求目标，受体的激动剂、拮抗剂以及调节受体结构和功能的药物正是这方面极有前途的研究对象。,6,* 从更深层次上看，受体和配给的结合属于研究蛋白质三维结构的重要内容，在分子生物学已进入后基因组时代的今天，这方面的研究有很重要的理论意义。,第一节 受体的放射配基结合分析,8,第一节 基本原理20世纪20年代末A.J.Clark发现药物效应与受体结合量呈正比且药物活性与受体亲和性有关。,9,提出占领理论：受体与配基以单分子相互作用（分子比1：1），结核反应是可逆的，亲和性相同，配基在结合和解离后不被代谢，也不与其它类型受体结合，受体与配基结合产生的生物效应的强度与受体被占领的量成正比，受体结合反应平衡后服从质量作用定律。,10,20世纪60年代初建立受体放射配基结合分 析（Radioligand Binding Assay of Receptors, RBA） 方法,11,受体放射配基结合分析法,一、放射性配基的制备 *对放射性配基的要求 ： 放射比活度高 亲和力高 特异性高 稳定性好,12,125I标记放射性配基的制备（可查相关文献） 1 氯胺-T法，N-氯代甲苯磺酰胺钠盐 2 Iodogen法，商品名为氯甘脲 3 乳过氧化物酶法 4 偶联标记法，标记游离氨基,13,受体标本的制备1 组织切片 新鲜组织冰冻切片-离体放射配基结合反应常规超薄切片电镜自显影2 完整活细胞 悬浮细胞：加入放射性配基进行结合反应，反应结束后取少量细胞，测量放射性。,14,贴壁细胞：待细胞长到90%左右去掉培养基，换为配基结合反应的缓冲液，不作成悬液，直接向贴壁细胞中加入放射性配基进行结合反应。 反应结束后，用冰冷的缓冲液洗去多余的游离配基，然后收集细胞，测定放射性。,15,3 亚细胞组分的差速离心法分离 全过程在4C下进行。 组织匀浆上清液 上清液 上清液（核受体） （800-3500g，15分钟）-（10000-30000g，20min）-（100000g，60min） 注意问题： 除去内源性配基和蛋白水解酶 受体标本保存，-70C保存 受体蛋白从从膜结构或核中溶脱成可溶性受体，洗涤或用溶脱buffer。,第二节 组织化学（histochemistry）技术,免疫组织化学（免疫细胞化学）是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原（受体）能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。,免疫组织化学(immunohistochemistry),图11 免疫组织化学（荧光素标记）毛细血管内皮细胞呈vWF阳性,图12 免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）胰岛B细胞呈胰岛素阳性,近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病，尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异，而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化技术，审慎判断其标记的意义。,24,免疫细胞化学的突出优点是： 1. 高度的特异性抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。,25,2. 高度敏感性现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。,26,3. 高分辨能力 免疫组织（细胞）化学经呈色反应，形成有色沉淀或荧光，可检测出细胞和组织内超微量抗原成分 4. 方法步骤统一若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。 5. 形态、机能和代谢密切结合是一种综定性、定位和定量密切结合；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。,27,缺点：,无法测定受体配基反应的亲和性,28,免疫细胞化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的，它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。,29,免疫细胞化学技术日新月异，以惊人的速度发展，尤其是和分子生物学的理论和技术日益结合密切，基因探针、核酸分子杂交技术、原位PCR技术、核酸杂交和免疫细胞化学双标记技术、电镜杂交技术等成为免疫细胞化学技术的新发展成员，标志着免疫细胞化学又进入了一个新的发展阶段。,30,核酸分子探针- 杂交-免疫细胞化学放大和显示杂交信号，可以称为杂交免疫细胞化学。所以，核酸分子探针的研制已成为免疫细胞化学实验室中必需的试剂生产技术，需要学习引进分子生物学的有关技术和设备，建立相应的基因工程实验条件，把基因重组技术、单克隆抗体技术和免疫细胞化学技术融合在一起，就成为了现代免疫细胞化学的新主体。更高倍电镜技术和图像分析，流式细胞仪技术的不断更新，把原位定性、定位和定量技术提高到了更新的水平，形成了免疫细胞化学发展的两翼，向着生物科学更广阔领域飞翔。,31,免疫细胞化学的全过程包括： 抗原提取和纯化 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体） 抗体效价检测和提取 标记抗体 细胞和组织切片标本的制备 免疫细胞化学反应和显色 观察和记录结果,32,由此可见，免疫细胞化学的基本理论是抗原抗体反应，标记化学反应和呈色化学反应。由于免疫细胞化学是在细胞和组织上进行抗原抗体反应，所以，必须熟练掌握显微标本制备的全过程，要求待检标本形态结构和抗原性保存良好，抗原不从原位扩散或丢失。所以，从事免疫细胞化学的工作者必须了解以下有关理论及掌握有关细胞和组织学技术。,33,一、细胞和组织免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十分重要的位置。,免疫细胞化学的标本制备,34,细胞标本的取材目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA 应用于胸腹水中间皮瘤与癌的鉴别。McAb应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、表面抗原特点以及肿瘤结构成分改变等方面的研究均起到了积极作用。,35,细胞标本的取材有以下3种方法：1. 印片法2. 穿刺吸取涂片法该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。3. 体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，更不宜加固定液。,36,如用细胞离心涂片器(Cytospin)，可将标本用上述离心沉淀法制成2105个细胞/ml的细胞悬液，吸取 50l 加入涂片器内，离心后即制成分布均匀的细胞涂片，细胞分布在直径约 6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个。,37,培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细胞、粘液癌细胞等，只需将载玻片或盖玻片插入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。,38,组织标本的取材组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡 2h以上的组织，可能有不同程度的自溶， 其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此， 尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。,39,组织标本的取材常常受到多种因素的影响，如各种内窺镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，出现人为的组织取材不准确。,40,为了避免上述缺点，组织取材时应注意： 活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压 取材部位必须是主要病变区 必须取病灶与正常组织交界区 必要时取远距病灶区的正常组织作对照,41,为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即作处理，或立即速冻成冰块进行冰冻切片，或立即用固定液处理，进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70冰箱内备用。,42,二、细胞和组织的固定固定为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。,43,不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大。如 T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较差，抗原活性容易丧失。 而 HBsAg 属稳定性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。,44,固定剂用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择。,45,1. 醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链和链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 10%钙-福尔马林液(浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml)。 10%中性缓冲福尔马林液 (浓甲醛10ml, 0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）。 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4 (多聚甲醛 40g, 0.1mol/LPBS 液 pH7.4 500ml，两者混合加热至 60，搅拌并摘加 1NNaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml)。 戊二醛-甲醛液(戊二醛10ml，蒸馏水加至100ml)。,46,2. 非醛类固定剂科学家比较几种非醛类双功能试剂发现，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。,47, 碳化二亚胺液 1-ethyl-3 (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide-HCL：2g溶于100ml 0.01mol/L,pH7.4 PBS中。此液宜用于标记多肽类激素的组织，对标记IgA、IgG效果不佳。,48, 碳二亚酰胺-戊二醛液(ECD-G液)ECD-1-ethyl-3 (3-dimethyl-aminopropyl) -Carbodiimide hydrochloride，即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐，简称乙基-CDI。该液常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究的良好固定剂。,49, Zenkers液重铬酸钾 2.5g, 氯化汞5g，硫酸钠1g，蒸馏水100ml，混合溶解后，临用时加冰醋酸5ml。该固定液对免疫球蛋白染色最佳、固定时间约24h，染色前必须脱汞色素。,50,3. 丙酮及醇类固定剂丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4 低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内510min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。,51,固定组织时应注意： 应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 组织块不宜过大过厚, 必须小于2cm1.5cm0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。 固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。 组织固定后应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。,52,固定方法1. 浸入法(Immersion method)将组织浸泡在固定液内， 必要时可在低温(4)环境下进行，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定， 一般在212h之间。,53,2. 灌注法(Irrigation method)此法适用于动物实验研究。灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织，达到充分固定之目的。灌注中洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。,54,三、组织切片技术应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5m左右，神经组织的研究要求切片厚度在 20100m，有利于追踪神经纤维的走行。,55,1. 冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。,56,2. 石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。,57,3. 振动切片用振动切片机(vibratotme)，可以把新鲜组织 (不固定不冰冻)切成厚片20-100m，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其适用于免疫电镜观察。,58,4. 塑料切片塑料包埋切片常用的埋剂有甲基丙烯酸盐类(Glycol methacrylate,GMA) 及环氧树脂类 (Epon 812,618)，其优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片, 光镜切片可薄至0.5-2m, 故称半薄切片(Semithin section)。GMA 保存抗原较好，不与组织产生共聚合，但形态学结构欠佳。,59,环氧树脂如Epon和Araldite 能较好地保存形态学结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时，半薄切片进行免疫染色时，抗血清不易穿透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本，切半薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜阳性检出率。,60,5. 超薄切片电镜标本制作，应用超薄切片机(Ultrotome)进行切片。,61,免疫细胞化学的分类和有关技术概述,62,一、分类根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术，免疫酶细胞化学技术，免疫铁蛋白技术，免疫金银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技术，免疫电子显微镜技术等。近些年来，核酸分子原位杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针，和免疫细胞化学技术密切结合，发展为杂交免疫细胞化学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。,63,二、抗体的制备和配制抗体的制备这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质，能够自制较好。,64,抗体的配制包括抗体的贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。,65,1. 抗体贮存获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的抗体效价，将其分装，可每10ul或 100ul/支分装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中，密封。放入-20-40冰箱中保存备用, 一般可保存12年。小量分装的抗体可1次用完， 避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在 4可存放13天，超过7天效价显著降低。,66,2. 抗体使用液的配制这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少，稀释使用各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色结果。,67,抗体稀释的配制：常用0.01mol/L pH7.4 PBS或 TBS 缓冲液作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体稀释液，防止抗体效价下降，减少抗体在组织上的非特异性吸附：取 0.05mol/L pH7.4 TBS 100ml，加温到60, 再加入优质明胶100mg，搅拌溶解后，冷却至室温，加入1g牛血清蛋白，加入 NaN3 200mg 溶解后，过滤，分装，4保存。,68,抗体的最佳稀度由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。,69,三、组织材料的处理组织材料的处理是获得良好免疫细胞化学结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏。,70,四、免疫染色可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是： 标记抗体与标本中抗原反应结合； 用PBS洗去未结合的成分； 直接观察结果(免疫荧光直接法)；或显色后再用显微镜观察 (免疫酶直接法)。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法。,71,在免疫染色中应特别注意增强特异性染色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题：1. 增强特异性染色的方法 蛋白酶消化法 合适的抗体稀释度,72, 温育时间大部分抗体温育时间为 3060min， 必要时可4过夜(约18h)。温育的温度常用37，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳。37可增强抗原抗体反应；适用于多数抗体染色，但应注意在温箱中进行，防止切片干燥而导致失败。,73, 多层染色法对弱的抗原可用间接法 (双层)、PAP和ABC法（三层）、四或五层PAP法或ABC法，或PAP的ABC联合染色法等，可以较大程度的提高敏感性，获得良好结果。,74, 显色增敏剂的应用如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，可提高显色敏感度4倍。,75,2. 减少或消除非特异性染色的方法组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:51:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入 2%5% 牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为 1020min。 也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清 (非免疫的)。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。,76,免疫荧光染色时，可用 0.01% 伊文氏兰 (PBS溶液)稀释荧光抗体， 对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入 0.85% 1% NaCl 成为高盐溶液，充分洗涤切片，能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。,77,3. 显色反应的控制免疫酶染色应注意控制： 成色质浓度和温育时间可调节，增加成色质的量和/或增加底物温育时间，可增加反应产物强度。着色太深可减少温育反应时间。 过氧化物酶显色时，H2O2 浓度大时将使显色反应过快而致背景加深；过量 H2O2 也可能抑制酶的活性。,78,4. 复染根据所用的染色方法和呈显颜色等，可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色，则用苏木素将细胞核染成兰色，以便定位检测。也可用1%2%甲基绿复染。,79,五、对照其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包括： 阳性对照； 阴性对照； 阻断试验； 替代对照； 空白对照； 自身对照； 吸收试验。,80,阳性对照用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。,81,阴性对照用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。,82,六、免疫细胞化学结果的判断对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用PAP法阳性，可再用ABC法验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。,83,特异性染色与非特异染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布有细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布，常为某一部位成片的均匀着色。细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。,84,非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。,85,阳性细胞的染色特征免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。 阳性细胞染色分布有三种类型 胞浆； 细胞核； 细胞膜表面。 大部分抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆。 阳性细胞分布可分为灶性和弥漫性。,86, 由于细胞内含抗原量不同， 所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。 阳性染色定位于细胞， 且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。 切片边缘、刀痕或皱折区域， 坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。,87,染色失败的几种原因 所染的全部切片均为阴性结果包括阳性对照在内，全部呈阴性反应，原因可能是： 染色未严格按操作步骤进行 漏加一种抗体，或抗体失效 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 底物中所加H2O2量少或失效 复染或脱水剂使用不当,88, 所有切片均呈弱阳性反应 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了 缓冲液配制中未加氯化钠和pH不准确，洗涤不彻底 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长 抗体温育的时间过长 H2O2浓度过高，呈色速度过快 粘附剂太厚,89, 所有切片背景过深 未用酶消化处理切片 切片或涂片过厚漂洗不够 底物呈色反应过久 蛋白质封闭不够或所用血清溶血 使用全血清抗体稀释不够,90,阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应，固定和处理不当是最常见的原因。对于阳性结果的定量判断常规办法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、+、+等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，使免疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。另一种先进的免疫细胞化学计量分类技术流式细胞光度计技术。,免疫组化标记的形态学特征,免疫组化标记具有形态学特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断，现择要分述如下：,一、阳性标记色度特征,免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原（受体）含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学因素外，可能与细胞只有轻度异常表达，或某些细胞摄取了周围组织抗原之故。,二、阳性标记细胞学特征,免疫组化标记中，阳性标记细胞学特征是反映抗原（受体）在细胞中的定位和分布情况。在诊断中阳性细胞以拟标记的细胞为前提，阳性表达必须在细胞特定的抗原（受体）部位，若不在抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使阳性也不应作为判断依据。根据抗原（受体）在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分为以下5种类型：,1.胞膜型 阳性颗粒主要分布于细胞膜表面，形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。此类型常见于某些膜抗原，如上皮膜抗原（EMA）、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原（GAA）和Ki-1等。,2.胞核型 阳性颗粒定位于细胞核，呈均匀分布或位于核膜下，有的呈小斑块状不规则分布。此多见于增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因p53等。,3.胞浆型 阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原均属于此种类型，如细胞角蛋白、波形蛋白、结蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特异性抗原（PSA）等。依据抗原在胞浆内分布形式，通常表现为弥漫性分布或局限性分布。前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆。局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧。,4.微绒毛型 抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛，而胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达。这种表现形式最常见于各种腺癌，如甲状腺腺癌、乳腺腺癌、胃肠腺癌、胆道腺癌、卵巢浆液性腺癌等。其特点是阳性颗粒除靠近腔面阳性外，其余基底部可呈阴性反应。在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等。甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现。,5.复合型 在常规免疫组化标记中，同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺ER和PR修复不充分也可以发生胞核和胞浆同时阳性。,三、阳性标记组织学特征,根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类型排列：,1.局灶型 阳性细胞呈不规则小灶性分布。阳性细胞可多可少，排列不规则，无固定排列形式，阳性染色深浅不一。神经丝蛋白、突触素在恶性神经内分泌肿瘤及低分化星形胶质细胞瘤中胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和恶性黑色素瘤中S-100蛋白等均可表现为局灶性阳性。,2.弥漫型 阳性细胞呈弥漫性分布，细胞间无连接，也可以单个细胞散在分布。此型中细胞几乎都高度表达某种抗原，如淋巴瘤（白细胞共同抗原）、胃肠未分化癌癌胚抗原（CEA）及上皮膜抗原、尤文瘤中CD99等。,3.片块型 较常见。阳性细胞多为细胞浆表达，细胞间界限较清晰，但相互融合呈片状或团块状结构。此型可见于上皮源性肿瘤、某些向上皮分化的间叶源性肿瘤、恶性黑色素瘤、中分化神经内分泌瘤及核形细胞瘤（如癌肉瘤和神经纤维瘤、平滑肌肉瘤）。,4.网状型 此型主要见于细胞密度较大的大细胞肿瘤，标记物多为膜抗原。阳性细胞膜与膜间相互紧靠，而胞核呈阴性反应，免疫组化标记显示网状结构。,5.腺管型 主要见于腺癌和具有腺癌样结构的胚胎性肿瘤。上皮标记物多为胞浆表达。胃肠低分化腺癌中有时HE很难鉴别腺样结构，但用癌胚抗原、上皮膜抗原或结肠癌相关抗原则容易显示出来。,6.菊团型 阳性肿瘤细胞排列呈菊团样结构，部分阳性细胞围绕血管排列。此型多见于分化较好的神经内分泌肿瘤和胶质细胞瘤等，阳性颗粒定位在细胞浆。,四、阳性标记强度特征,细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性；也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为：弱阳性，阳性细胞25%；中阳性，阳性细胞25%50%；强阳性，阳性细胞50%。,五、非特异着色特征,以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断：（1）抗体交叉反应： 是由于该抗原决定簇同时存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严重，可表达于多种组织细胞。因此，应全面了解和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反应只要应用得当仍有助于诊断。,（2）肿瘤细胞异常表达： 可选用多种标记去证实或排除，鉴别其真正组织来源或向某一组织细胞分化。（3）肿瘤细胞吞噬组织抗原：是由于某些恶性肿瘤细胞摄入周围正常组织细胞成分，虽然后者也存在某些抗原，但不属于瘤细胞固有成分，胞浆内抗原定位较模糊，因此应该区别。,（4）非特异性染色 是指抗原无明确定位，肿瘤细胞与间质细胞、细胞与间质均为黄色，相互累及一片，色度无深浅之分。这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断依据。,非特异性染色的原因常为组织标本固定不佳、抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，如前所述，阳性颗粒应位于细胞胞膜、胞浆或胞核，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。如果缺乏细胞间的不均一性染色，即是呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊断依据。,免疫组化结果的判断原则及对假阴性和假阳性的认识,一、 免疫组化结果的判断原则 免疫组化具有特异性强、敏感性高及定位正确等优点，但随着免疫组化应用的普及和深入，越来越多的问题也随之出现。因此，掌握对免疫组化结果的判断原则是很重要的。,1.必须设染色对照 每批染色都要以特异性的阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做出正确的判断。没有阳性对照，就不能做出真正阴性结果的判断；同理，没有阴性对照，也就不能做出真正阳性结果的判断。因而，没有对照的免疫组化染色，即使做出了判断也是不可信的。,2.抗原表达必须在特定部位 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性，如LCA在细胞膜上、Keratin在细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内，EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。,3.阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性结果不能认为具有否定意义；阳性表达有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。,4.免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准 当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。,二、引起假阴性和假阳性结果的原因,1.假阴性结果的原因主要是：（1）抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度；（2）由于组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固定之标本；（3）操作步骤不当，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高；（4）组织或细胞中抗原的含量很低，所用的方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。,2.假阳性结果的主要原因是：（1）所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现；（2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合；（3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色；,免疫组化操作经验和体会,操作中应注意以下问题：1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。3.PBS洗涤要充分。4.要设阴性和阳性对照。5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。,6.消除内源性生物素活性：预先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min。7.ABC复合物应在临用前30min配置。8.ABC试剂保存温度以4 为佳，保存达数年仍可获满意效果。9.抗体保存：-20 分装冻存，或于4 常规使用，切忌反复冻融。,（一）均匀的背景染色1.酶-底物反应时间过长。2.在孵育中切片干燥。3.一抗或二抗稀释度不够。4.切片洗涤不充分。5.封闭所用的正常血清不对。,免疫组化常遇问题,（二）部分区域背景着色1.切片部分区域干燥。2.显色反应物在封片介质中是可溶的，造成弥散。（三）部分区域不着色1.脱蜡不完全。2.切片部分区域干燥。,（四）各种孵育结果所有抗体均不着色1.H2O2终浓度不够或存放过久失效。2.稀释液中有错误的正常血清（如猪抗兔酶标抗体稀释液中有正常兔血清）。3.显色反应物溶于脱水的酒精、二甲苯或封片液中。,（五）某些抗体不着色1.需要消化而没有消化。2.封闭内源酶时使抗体活性下降。3.切片在裱片或干燥时过热。4.抗体过度稀释，一抗浓度小于二抗。5.抗体过期或频繁冻融.,（六）内源性酶活性： H2O2 -甲醇封闭不恰当。（七）脱片1.切片无粘附试剂。2.切片不干净。3.冰冻切片：组织在贴片前已经充分固定。（八）核轮廓模糊1.切片已干燥（特别是冰冻切片）。2.苏木素染液欠佳。,（九）非特意性色淀1.底物-显色液使用前未经过滤。2.抗体使用前未离心。（十）阳性反应太弱1.抗体或其它试剂活性下降。2.显色反应时间过短。3.某些抗体的稀释度或孵育时间不够。4.当加抗体时切片上缓冲液过多。,（十一）切片镜下模糊或黑点沉着1.脱水不彻底：进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯混合液。2.温箱干燥替代脱水过程。,133,134,原位杂交术（in situ hybridization）,即核酸分子杂交组织化学术，检测基因（DNA片段）的有无、基因的表达活性（mRNA）原理：用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸按碱基配对原则进行特异性原位结合（杂交），并通过对标记物的显示而获知待测核酸的有无及相对量常用标记物：放射性核素、地高辛,135,探针（probe）DNA或RNA片断（一般30-40bp）组织穿透力强标记：同位素（放射自显影） 地高辛,137,放射自显影术（autoradiography）,概念：通过活细胞对某种放射性物质的特异性摄入，以显示该物质在组织和细胞内的分布、含量和代谢过程，借以反映细胞的功能状态应用举例 用3H标记的胸腺嘧啶核苷研究DNA合成和细胞增殖状态 用125I 观察甲状腺滤泡内碘化部位,139,3H的分辨率高，但放射自显影时间长，一般需几周或更长时间。32P能量最大，放射自显影时间短，需几天，但分辨率低。35S介于两者之间。,140,1. 18cm不锈钢高压锅或 电炉或医用微波炉；2. 水浴锅,原位杂交操作,一. 仪器设备,141,二. 试剂,0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。0.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。20SSC(pH7.0)：NaC