array技术在PGS中的应用

Array CGH在PGS中的应用,沈鉴东江苏省人民医院 生殖医学中心,胚胎植入前遗传学诊断,胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）：最早期的产前诊断（PND），亦称为孕前诊断1968年，Gardner RL和Edwards RG第一次在动物模型（兔子）上行PGD性别选择1990年， Handyside等报道了世界第 1例人类植入前性别诊断婴儿的出生目前有超过100个IVF中心可以开展PGD服务，有超过4000个PGD婴儿出生,PGD & PGS,PGD的主要指针： 染色体异常：平衡易位、罗氏易位、倒位等 单基因疾病：常显、常隐、X连锁植入前HLA配型、非整倍体筛查胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening, PGS): 非整倍体筛查,PGS的指针,女方高龄（AMA）：大于35岁反复自然流产（RM）：核型正常，不明原因的反复自然流产超过3次反复种植失败（RIF）：即使是高质量的胚胎移植，也失败超过3次严重的男性不育（SMF）：少弱精子症、畸精症其他：曾有过因遗传因素导致的异常妊娠，胚胎质量差，前期曾接受过放射治疗、单胚胎移植等,PGS一般流程,胚胎活检,单细胞FISH技术流程,Step 1: 卵裂球固定,1) 吸取卵裂球,2) 低渗,(Leave for 30 Seconds),3) 将卵裂球移到玻片上,Patient Details,4) 在显微镜下滴加固定液轻轻吹促进固定液挥发重复滴加固定液指导胞浆裂解，消散,单细胞FISH技术流程,Step 2: FISH杂交,A,A,T,T,C,G,G,T,A,G,1) DNA变性,2) 探针变性,T,A,G,T,A,G,T,G,T,C,A,A,T,T,C,G,G,A,T,C,A,C,A,G,杂交,4) 荧光显微镜下观察,多色FISH（M-FISH）,筛查流产胚胎常常涉及到的染色体的数目异常： X， Y， 13，15， 16，18， 20，21 ， 22,-ESHRE PGD consortiumHuman Reproduction，2010,2007, Europe 57 center, 3753 cyles,PGS 利 or 弊?,1995年Verlinsky和Munne分别首次报道使用极体活检行PGS2007年Mastenbroek等设计多中心，随机，对照，双盲研究，认为PGS组种植率、持续妊娠率、活产率均低于对照组(Mastenbroek S et al. N Engl J Med. 2007),病人的选择不合适、FISH探针的选择不充足、活检导致的损伤、胚胎活检率低、不能诊断胚胎率高 (Cohen J, et al. Reprod BioMed Online, 2007; Kuliev ,et al. Reprod BioMed Online, 2008),胚胎活检时机的选择,极体活检D3胚胎活检滋养外胚层活检,FISH技术不足之处,核丢失（Loss of nuclei）: 固定、洗片杂交失败（Failure to hybridization) ：胞浆覆盖、变性不充分等信号叠加(Overlapping of singals）：模棱两可的信号检测染色体数目有限,PGS发展新动向,Array技术（array CGH/SNP array） “基因芯片”是指通过微阵列技术将高密度DNA片段通过高速机器或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因组水平研究的最新革命性技术快速、高通量、高精密度,Array技术平台,Array CGHSNP array,CGH/array CGH,SNP array,array CGH VS. SNP array,平台资金投入实验操作结果分析单基因疾病PGD,Cases Review,Case 1,女方输卵管阻塞，IVF-ET，反复流产2次，末次绒毛染色体69，XXY。处理方案：4个冻胚-24sure PGS,Embryo 1： Normal. Transferred and Pregnancy,Embryo2：Normal,Embryo3： +1,+2,-16,-21,Embryo4：-1,-9,-18,+20,Case 2,男方为X-linked CMT （GJB1）女方反复流产2次，末次绒毛染色体47，XY，+16处理方案：24sure PGS,Embryo 1: -9,16; male,Embryo 2: Normal, female,Embryo 3: -2,8,9,10,16;+18,male,Embryo 4: Normal female,Embryo 5: Normal, Female,Embryo 6: Normal, Male,Amelogenin,Embryo1：Male,Embryo2: Female,Embryo3: Male,Embryo4: Female,Embryo5: Female,Embryo6: Male,Male gDNA,Array CGH in PGD,-Fiorentino F, et al . Human Reproduction, 2011,PGD for 46,XX,t(1;8)(p34;p22),-Fiorentino F, et al . Human Reproduction, 2011,-Fiorentino F, et al . Human Reproduction, 2011,PGD for 46,XY,t(5;8)(q31.1;q22.1),在187个诊断胚胎中，81个易位片段平衡的胚胎中有51个存在其他染色体的非整倍体，真正平衡的胚胎只有30个（16%）。在平衡易位和罗氏易位的携带者PGD过，对其它染色体的倍性筛查比较重要。临床妊娠率