血小板聚集率测定

血小板聚集率测定标准化操作及临床应用石冬敏 南京医科大学附属苏州市立医院本部 (苏州 215002)关键词：血小板聚集率；标准化；诱导剂；血栓；血管壁受损、血小板活化导致血小板粘附聚集和释放反应增强是许多疾病中血栓形成的重要条件，使用抑制血小板功能的药物已成为预防和治疗血栓性疾病的常规疗法1。近年血小板聚集率测定在疾病的诊断治疗和用药监测的作用受到重视2。本文从血小板聚集率测定及标准化操作和临床应用三方面进行阐述，并着重讨论血小板聚集率测定在老年动脉粥样硬化的应用。一、血小板功能检测最早的检测血小板功能的方法是出血时间。它操作简单快速，但受技术人员的操作技术，皮肤厚度和温度的影响。且这一方法“在血小板减少的患者测定血小板功能的缺陷时作用有限”。3已淘汰。现有的血小板功能试验包括血小板粘附试验、血小板聚集试验（PAgT）、血浆血小板球蛋白和血小板因子4测定、P-选择素测定、血小板因子3有效性测定、血块收缩试验、血栓烷B2（TXB2）检测、11-脱氢-血栓烷B2（11-DH-TXB2）、血小板环核苷酸测定、血小板钙流的测定、5-羟色胺的测定、血小板凝血酶敏感蛋白测定、血浆纤维连接蛋白测定、血小板膜糖蛋白测定、同种血小板抗体的检测4。目前评价血小板功能最常用的方法是PAgT。二、PAgT和诱导剂PAgT包括第一相聚集与第二相聚集，血小板与外源性诱导剂接触后即发生聚集称第一相聚集，亦称初级聚集，指加入诱导剂1分钟的血小板聚集率PAG(1)，它与GPb/a和Fg的相互反应有关，如GPb/a或/和Fg有缺陷，第一相聚集减低。第一相聚集诱导血小板活化，血小板结构发生变化，释放出ADP等内源性致聚剂，加剧血小板聚集，称为第二相聚集，又称次级聚集，指加入诱导剂3分钟的血小板聚集率PAG(3)，如血小板释放反应有缺陷，第二相聚集减低。血小板聚集诱导剂有：二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸（AA）、肾上腺素、胶原、凝血酶、瑞斯托霉素和前列腺内过氧化物。不同的血小板诱导剂对血小板的作用有所不同。弱活化剂ADP只能引起较微弱的释放反应，依赖于第一相聚集的跨膜信息传递活化血小板，导致第二相聚集。当ADP为0.3mol/L时，仅有初发聚集波(第一聚集波)；当ADP为0.5mol时，可出现双相聚集波(第二聚集波)；ADP1.0mol时，有一个不可逆转的单相波形，即血小板聚集试验5分钟产生的聚集曲线5,6。凡是促进血小板中的cAMP减少的物质如ADP、AA、肾上腺素、凝血酶、5-HT、PGG2、PGH2等，都可诱导血小板的聚集；反之，凡是可以使血小板中的cAMP增加的物质如肾上腺素能阻滞剂、肾上腺素能兴奋剂、PGE1、PGD2、PGI2、腺苷、咖啡因、氨茶碱、潘生丁等，都可抑制血小板的聚集。三、PAgT原理和测定血小板聚集检测可分为光学法（PRP比浊法）、阻抗法、血液灌注压法、发色底物/发光物-聚集剂法、非离心式聚集阈值测定法和切变诱导血小板聚集法。不同的测定方法与PRP聚集测定结果相关性不同7。光学法又分为透射比浊法和散射比浊法，本文重点阐述常用的透射比浊法。1、原理：在磁力搅拌条件下，在PRP中加入诱导剂，血小板发生聚集，悬液浊度随之下降，透光度增加，据透光度变化曲线计算血小板聚集率8。2、方法：静脉采血，与枸橼酸钠抗凝剂9:1在硅化管内混匀。样本低速离心（1000rpm）5分钟，取上层富含血小板血浆（PRP）置37预温。PRP中血小板计数应当标准化，以250-300109/L为宜。可通过加入贫血小板血浆调整。样本再以3000rpm离心10分钟，制备贫血小板血浆（PPP）作为空白对照。将小磁珠放入含有PRP的比色皿中，在聚集仪中磁珠以1100rpm转动，加入诱导剂，记录透光度变化曲线。四、PAgT实验标准化操作PAgT影响因素多，结果变异大，调查表明操作者变异、批内变异和天间变异约范围15-56%9,10。因此，标准化操作十分必要。主要因素有：1、药物：阿司匹林，潘生丁，肝素，双香豆素等均可抑制血小板聚集。阿司匹林抑制血小板聚集作用可持续1周，故采血前1周内不应服用此类药物11。2、采血：静脉采血,避免反复穿刺或气泡混入。组织液可使少量凝血酶形成引起血小板聚集。应使用109mmol/L枸橼酸钠厚壁双倍硅化内壁（无死腔）真空采血管，因为“死腔”可激活血小板，使血小板第4因子提前消耗，PAgT降低。有的抗凝管加入潘生丁等药物，可抑制血小板聚集12,13。3、抗凝剂：使用单一的枸橼酸钠抗凝剂，血与抗凝剂9:1为宜，血小板聚集作用随血浆中枸橼酸钠浓度的降低而增高。忌用EDTA作为抗凝剂，EDTA由于螯合Ca2+作用强，使ADP不能引起血小板聚集14。4、时间：制取PRP后30分钟内不应进行测定，因此时血小板反应性差。但整个测定须在2小时内完成15,16。5、诱导剂：ADP在保存中会自行分解产生AMP，所以配制成溶液后宜在-20冰箱中贮存。一般半年内活性不会降低。AA性质不稳定性，配制贮存运输过程均要求-20。应用肾上腺素时，应裹以黑纸避光，以减少分解。6、比浊法测定PAgT时，比色皿应选择水晶材质，经常清洗，防止蛋白和色素沉积，造成透光度下降。我们用COULTER CLENZ TM 清洗液浸泡后蒸馏水冲洗效果较好17。7、测定操作：PRP不可混入红细胞，测定量200ul 为宜，磁珠直径不可小，否则均可致结果偏低。五、PAgT的临床应用PAgT无需昂贵的仪器和特殊的试剂盒，便于基层实验室开展，操作简单，半小时内即可得出结果，适用于临床诊断，特别是某些急症患者。临床应用有以下3方面：1、血小板聚集功能亢进能敏感的发现血栓前状态。当血液处于高凝状态，如伴有血管内受损或血流缓慢则称为血栓前状态。它易导致血栓栓塞形成或加重栓塞的病理过程的发生和发展，引起一系列的疾病。见于DIC早期、高凝状态和血栓性疾病，如急性心肌梗塞、心绞痛、糖尿病伴血管病变、脑血管病变、高-脂蛋白血症等。PAgT增高，可以为上述疾病的诊断和治疗提供依据，针对病因进行治疗。2、血小板聚集率是出血性疾病诊断的常用指标。如GPb/a或/和Fg有缺陷，PAG(1)减低，如血小板释放反应有缺陷，PAG(3)减低。可初步筛检血小板无力症、巨大血小板综合症、贮存池病及纤维蛋白血症、尿毒症、肝硬变、Wilson病、维生素B12缺乏症和感染性心内膜炎等。3、不同诱导剂的血小板最大聚集率（MAR）测定对临床用药的监测作用是血栓与止血研究课题。肠溶阿司匹林廉价，广泛运用于冠心病的一、二级预防。国际抗血栓联合组的65个临床试验发现，应用阿司匹林（ASA）可减少各类栓塞和血栓事件约23%18。抗血小板聚集实验者协会分析了超过10万例治疗者的资料，表明ASA能使心肌梗死和脑卒中的发生率降低25% ，血管移植、动脉栓塞发生率减少48% ，肺栓塞发生率减少67%，深静脉血栓发生率减少2319。但仍有部分患者没有抗血栓效应而发生心脑血管血栓事件，这种现象称为阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)20。氯吡格雷安全性与ASA类似，价格略贵，一般用于AR患者21。两种药物的差别在于药理机制不同，ASA的抗血小板作用在于抑制细胞内环氧化酶，ASA使血小板内花生四烯酸代谢途径的环氧化酶活性基因第529位丝氨酸乙酰化后失去活性，从而抑制血栓烷A2（TXA2)的生成。ASA是不可逆的，口服单剂量的ASA的抗血小板作用可持续7 d，接近血小板的平均生存期（9-10 d），直至骨髓产生新的血小板。研究表明，小剂量ASA对血小板环氧化酶有明显抑制作用，对内皮细胞环氧化酶抑制作用弱，因为内皮细胞有再生环氧化酶能力。ASA同时可抑制血管内皮细胞前列环素（PGI2），此点尚有争论 34 。氯吡格雷是一种新型的噻吩并吡啶类衍生物，能选择性的与血小板表面腺苷酸环化酶偶联的ADP受体结合而不可逆地抑制血小板聚集。抑制ADP诱导的MAR作用在37天达到稳态。稳态时对血小板的平均抑制水平维持在4060%22。由于ASA减少AA代谢生成血栓素，阻断了AA代谢途径，因此对AA诱导的MAR的抑制更显著。氯吡格雷由于能直接抑制血小板表面的ADP受体，因此对ADP诱导的MAR抑制显著。单以MAR很难判断氯吡格雷和阿司匹林哪个抗血小板作用更强，国外的大型临床试验通过对心血管事件的发生率的长期观察更科学可信23。2种药物最严重的副作用是出血。MAR测定可能是确定药物个体化用量的途径，氯吡格雷监测以ADP诱导MAR为佳，阿司匹林调整理想剂量的指标应重视AA诱导的MAR 。该测定可能是监测阿司匹林抵抗和出血的最佳途径，当阿司匹林将AA完全阻断，此时可能出现AA诱导MAR低于5%，而ADP诱导MAR仍在40%左右，阿司匹林抵抗和出血可能产生，当深入研究。六、PAgT在老年动脉粥样硬化的应用阿司匹林肠溶片因用药不当诱发出血并不鲜见。氯吡格雷是一种新型抑制血小板药物，多用于阿司匹林抵抗患者，该类患者约占接受阿司匹林治疗者的10%，且多为高龄老干部24、25。不同诱导剂的血小板最大聚集率（MAR）测定常用于安全用药监测，亟待自动凝血分析仪应用开发。我们实验分析对比老年动脉粥样硬化患者应用氯吡格雷和阿司匹林治疗前后的花生四烯酸（AA）和二磷酸腺苷（ADP）诱导的MAR。报告如下： （一）材料与方法1、临床资料 2005年2月2007年2月住院的稳定状态的动脉粥样硬化症患者79例，年龄7290岁，平均77.8.13.9岁，男性60例，女性19例。均为国际动脉粥样硬化学会预防动脉粥样硬化性心血管疾病综合指南所确定的高危人群26，具有以下任何一项诊断者：1、稳定型心绞痛或冠脉内支架安置术后；2、彩色超声提示颈动脉斑块或曾有脑梗塞病史或短暂性脑缺血病史者；3、彩色超声提示下肢动脉粥样斑块形成。排除标准：急性血栓形成（冠脉综合症、脑卒中急性期）；高血压未能很好控制；机械性人工瓣膜和服华法林抗凝者；严重肝肾功能不全；临床明确的血小板减少症或中性粒细胞减少症及严重感染。入选者随机分成氯吡格雷组27例，阿司匹林组26例，对照组26例。各组临床资料见表1。MAR测定实验室正常对照为40例健康体检者，年龄45.711.6岁，男/女比例1.0。表1 不同治疗组临床资料及疾病分布n=79氯吡格雷组阿司匹林组对照组 例数272626 年龄(岁)78.74.277.54.177.33.3男/女21/619/720/6动脉粥样硬化:冠心病374颈动脉斑块1189下肢动脉斑块110脑梗塞、短暂性脑缺血 121013合并症:蛋白尿534高血压1413142型糖尿病766慢性心衰232动脉粥样硬化疾病组成:X2=2.831,P=0.586 ；合并症疾病组成:X2=0.770,P=0.9932、方法 临床实验为随机、平行研究。均针对原发病治疗，避免使用抗凝剂和其它抗血小板药物。氯吡格雷组早餐后口服波利维（赛诺非-德拉堡公司产品，批号：1949 ，每片75mg）75mg.d-1，7天；阿司匹林组早餐后口服阿司匹林肠溶片（济南永宁制药公司产品，批号：061102 ，每片25mg）100mg.d-1，7天；总疗程2周，包括1周安慰剂清洗期和1周药物治疗期；对照组未使用任何抗血小板药物。均在治疗前后用109mmol/L枸橼酸钠小容量（2.7ml）厚壁双倍硅化内壁真空采血管（无死腔）晨空腹采血，立即用透射比浊法测定AA和ADP诱导的MAR27 。3、仪器与试剂：抗凝管由BD公司生产。采用普利生LBY-NJ2血液凝聚仪，诱导剂AA终浓度为200mg/L，由上海度生公司提供；ADP终浓度为11.2umol/L由普利生公司提供。4、统计分析：数据以xs表示,计数资料采用X2检验，治疗前后的计量资料采用配对t检验，组间比较采用F检验。（二）结 果1、表1 资料表明，3组患者男：女分别为3.5、2.7和3.3；组间性别、年龄、病种X2检验差异无显著性（P0.05） 。具有可比性。2、本实验室正常对照值AA诱导MAR为43.115.7；ADP诱导MAR为64.117.0 。与对照组治疗前后MAR值（见表2）比较（0.05），无显著差异。表明本实验质量控制较好，结果可靠。3、氯吡格雷组1例因皮疹退出，其余均完成实验。各组治疗前后MAR测定值配对t检验见表2 。氯吡格雷组和阿司匹林组治疗后MAR均降低，均有非常显著差异（P0.05）。表明2组药物治疗后2种不同诱导剂的MAR下降均具有统计学意义。表动脉粥样硬化患者氯吡格雷和阿司匹林治疗前后不同诱导剂MAR配对t检验（xs）诱导剂 氯吡格雷组n=26 阿司匹林组n=26 对照组n=26 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后AA 47.014.3 36.118.6* 49.617.6 13.612.6* 48.220.6 46.917.3ADP 63.512.8 36.716.8* 64.716.6 50.316.7* 62.910.8 65.415.1注：* P0.014、2组药物治疗前后2种诱导剂MAR差值见表3 。方差齐性检验各组方差齐性（F=1.540.05）。方差分析见表4，4组间有非常显著差异（P0.01）；各组两两分析比较见表5，各组间均有非常显著差异（P0.01）。分析结果表明2组药物治疗后用不同诱导剂测出的MAR均有差别。表3 氯吡格雷组和阿司匹林组治疗前后2种诱导剂MAR差值(x s) 诱导剂 氯吡格雷组(n=26) 阿司匹林组(n=26) 治疗前后差值（d） AA 13.112.5 38.115.5 ADP 28.413.5 18.714.1表4 方差分析表变异来源 平方和 自由度 均方 F P组间效应 9457.6 3 3152.5 218.0 0.01组内效应 1445.6 100 14.5总变异 10903.2 103表5 各组两两比较比 较 处理数(T) 平均数差值 标准误*Q值(0.01,Ti100) P阿司匹林AA :氯吡格雷AA 4 38.1-13.1=25.0 0.746*4.5=3.357 0.01阿司匹林AA :阿司匹林ADP 3 38.1-18.7=19.4 0.746*4.2=3.133 0.01阿司匹林AA :氯吡格雷ADP 2 38.1-28.4= 9.7 0.746*3.7=2.760 0.01氯吡格雷ADP:氯吡格雷AA 3 28.4-13.1=15.3 0.746*4.2=3.133 0.01氯吡格雷ADP:阿司匹林ADP 2 28.4-18.7= 9.7 0.746*3.7=2.760 0.01阿司匹林ADP:氯吡格雷AA 2 18.7-13.1= 5.6 0.746*3.7=2.760 0.015、2组药物治疗前后2种诱导剂MAR结果见图1。如图所示：氯吡格雷治疗后AA诱导的MAR下降率约为服药前的23.2%；ADP诱导的下降率约为42.2%；而阿司匹林则相反，治疗后AA诱导的MAR下降率约为服药前的52.4%；ADP诱导的下降率约为22.3% 。表明药物的药理作用不同，从临床用药安全性监测角度考虑，氯吡格雷抑制二磷酸环化酶作用较强，治疗期间更应重视ADP诱导的MAR；阿司匹林抑制花生四烯酸代谢较强,治疗期间更应重视AA诱导的MAR指标的下降。（三） 讨 论1、阿司匹林肠溶片是抗血栓治疗常用药，因用药不当诱发出血并不鲜见。氯吡格雷是一种新型的噻吩并吡啶类衍生物，能选择性的与血小板表面腺苷酸环化酶偶联的ADP受体结合而不可逆地抑制血小板聚集，抑制ADP诱导的血小板聚集率作用在37天达到稳态。稳态时对血小板的平均抑制水平维持在4060%28、29、30 ，近年多用于阿司匹林抵抗患者31，该类患者约占接受阿司匹林治疗者的10%，且多为高龄老干部。体外测定MAR常用于安全用药监测。本实验入选患者的平均年龄78岁，全部为稳定状态的动脉粥样硬化患者。2、 血小板聚集包括第一相聚集与第二相聚集。加入诱导剂1分钟的血小板聚集率称第一相聚集，又称初级聚集PAG(1)，与GPb/a和Fg的相互反应有关，如GPb/a或/和Fg有缺陷，第一相聚集减低。在第一相聚集的诱导下血小板活化，结构变化，释放ADP等内源性致聚剂，加剧血小板聚集，称第二相聚集，又称次级聚集，指加入诱导剂3分钟的血小板聚集率PAG(3)，如血小板释放反应有缺陷，第二相聚集减低。MAR是加入诱导剂45分钟之间的血小板最大聚集率32。凡是促进血小板中的cAMP减少的物质都可诱导血小板的聚集如：ADP、肾上腺素、胶原、凝血酶、瑞斯托霉素和前列腺内过氧化物。不同诱导剂对血小板的作用不同33。ADP诱导MAR是测定血小板活性的常用方法。AA性质不稳定性，配制贮存运输均要求-20，有些实验室弃用在于该分寸未掌握。MAR测定值临床可信度在于采血、分离和比色等环节的质量控制。近年来应用自动凝血仪提高了血栓与止血的检测质量，我们期待MAR测定的全自动分析。本实验对照组治疗前后MAR均值与总体均值检验无显著差异，表明实验质量控制较好，结果可靠。3、以使用不同诱导剂的MAR，很难判断氯吡格雷和阿司匹林哪个抗血小板作用更强，国外的大型临床试验通过对心血管事件的发生率的长期观察更科学可信。本文结果显示，应用氯吡格雷和阿司匹林治疗后MAR的下降均具有统计学意义。两种药物的差别在于药理机制不同，氯吡格雷直接抑制血小板表面的ADP受体，因此对ADP诱导MAR抑制显著；阿司匹林的抗血小板作用在于不可逆的抑制细胞内环氧化酶，减少AA代谢生成血栓素，由于阻断了AA代谢途径，因此对AA诱导MAR抑制更显著。4、本观察表明，MAR测定可能是确定药物个体化用量的途径，使用不同的诱导剂可产生不同的结果。从临床用药安全性监测角度考虑，氯吡格雷监测以ADP诱导MAR为佳，阿司匹林调整理想剂量的指标应重视AA诱导MAR，该测定可能是监测阿司匹林抵抗和出血的最佳途径，当阿司匹林将AA完全阻断，可能出现AA诱导MAR低于5%，而ADP诱导MAR仍在40%左右，阿司匹林抵抗和出血可能产生，当深入研究。参 考 文 献1、齐若梅 血小板与血栓形成 世界医学杂志，2002，11：54-562、王新德，刘芳 血小板聚集功能检测在阿司匹林预防缺血性脑血管病中的应用 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