临床基因扩增检验操作规范

临床基因扩增检验操作规范,浙 江 省 基 因 诊 断 中 心浙江大学医学院附属儿童医院 尚世强,一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析,一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能,规范化设置： 要求参照临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发2002 10号文）附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。,1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。 2. 明确的标记，如加样器或试剂等。 3. 单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、 标本 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简 称扩增区）至产物分析区。 4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。 5. 实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。 6. 各自的清洁用具。,各室功能：,（一）试剂贮存和准备区,功能： 贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。,含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。,（二）标本制备区,功能： 临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。,要正确使用加样器。 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。 用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。,（三）扩增区,功能： DNA或cDNA扩增。,已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。 可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 如有加样则应在超净台内进行。 打开反应管前快速离心数秒。,（四）扩增产物分析区,功能： 扩增片段的测定。,膜上微孔板上探针杂交方法、 Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。 本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。 负压条件。,二、各阶段操作要求,测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。,（一）标本的采集,临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。 EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。 玻璃器皿在使用前应高压处理，250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。 临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。,（二）标本的稳定化处理,DNA：不需特殊稳定化处理。 RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使 DNA酶和RNA酶失活。,（三）标本的运送,可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。 未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。,（四）标本的贮存,1. 血清/血浆等 -70 2. 用于DNA测定的已纯化核酸样本 43. 用于RNA测定的已纯化核酸样本 -80 4. 用乙醇沉淀的核酸样本 -20 5. GITC处理的RNA标本在室温可保存7天,（五）标本的处理（核酸提取）,抑制物可能来源于： 标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。 核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。 痰须液化处理。,操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：离心管不能插得过低，以防进水；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时间须准确，101 min； 水浴时不能走开；左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。,（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增,有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg+浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。 扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。,RT-PCR操作注意：,标本必须新鲜；做RNA标本的枪头离心管必须无菌；冰上操作；处理完后须立即上机，不能放置；注意左右手分开。,（七）扩增产物的分析,扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。,实时荧光定量PCR,在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最后通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR一般使用Ct（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光PCR的优点：精密度高，重复性能好。,TaqMan荧光定量PCR原理,探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，Taq DNA聚合酶的5-3外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；,三、PCR污染与对策,PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR污染源有三个：第一、标本间的交叉污染；第二、实验室中克隆质粒的污染；第三、PCR产物的污染（Carryover）。,要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作：（一）污染的预防（二）污染源的追踪（三）污染源的处理,（一）污染的预防,操作PCR时，按照下述规则可有效地预防PCR的污染。1、PCR的前处理及后处理要在不同的隔 离工作台上或房间内进行。2、分装试剂，标记批号,3、改进实验操作： (1) 带一次性手套； (2) 避免反应液的飞溅； (3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于 空气，以免产物气溶胶污染； (4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分 (dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准 混合液(Master mix)； (5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA， 加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧 反应管。4、检查结果的可重复性。,（二）污染源的追踪,1、阳、阴性对照,选择阳性对照时，应选择扩增弱， 且重复性好 的样品。 阴性对照的选择一定要小心。 不含模板DNA的PCR试剂对照。,2、常见的环境污染源有,(1) 点杂交的点样器；(2) 切片机；(3) 离心机；(4) 切胶用刀或微解剖刀；(5) 浓缩用具，真空瓶；(6) 电泳装置和紫外灯箱；(7) 干冰/乙醇或水溶锅；(8) 冰箱门把手、冷冻架和门把手。,追踪可疑的环境污染源, 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分 在0.1ml 去离子水中浸泡； 取5l 作PCR反应； 电泳检查结果。,（三）污染源的处理,1. 环境污染处理法,（1）稀酸处理法。 对擦试实验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡残留DNA。（2）紫外法： UV照射波长一般选择254/300nm，需考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV对长片段（500bp以上）有效，而对短片段效果不大。,2. 反应液的污染处理法,(1) DNaseI法： PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5U DNaseI，室温下作用30min后，加热灭活，加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。 优点：便宜，不需知道扩增DNA序列。,(2) 内切酶法： 选择识别四个碱基的内切酶（如MspI等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.01.5h。(3) 紫外照射法： 反应中不加模板与Taq酶。,(4) 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法： dUTP代替反应中的dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物的污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影响 。,T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A A 加热 A A A PCR,该法优点： 去除任河来源（包括引物在内）的 污染； 由于污染的产物有大量dU存在， 因此，UNG处理会彻底消除污染。 UNG处理与PCR扩增可在同一试管 内进行。,四、因操作欠规范导致的问题分析,（一）实验室仪器设备,1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳定，引起假性结果。 旋涡混合器，微量加样器，正规的紫外透射仪。 RNA PCR样品处理时，血清（或血浆）中加入强 烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。 吸头与微量加样器不配套。2、PCR热循环仪的差异或质量问题。,移液器：,严禁大力来回拧动；严禁调至容量之外使用；第二档为排空档，不得作吸取之用；吸头应浸入液面23mm处吸取；严禁将有液体的移液器平放或倒置；混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。,离心机：,离心前，离心管须配平；将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速；定时旋钮不能强行归零；转头未停止时，严禁打开盖板。,（二）实验室布局不合理引起的污染问题,1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片 段均会通过空气进行传播。2、PCR结果检测实验室和其它实验室在一 起，会出现严重的扩增子污染。3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公 用，也会造成严重污染。4、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯 等）乱 放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室 污染。,（三）PCR操作中存在问题分析,1.阳性变阴性2.阴性变阳性3.PCR结果不稳定,1.阳性变阴性,(1) 有些阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况： 一是采集标本方法或部位不正确， 二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。,(2) 标本保存不当，可引起PCR失败。 收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR检测的模板或造成标本污染。,2.阴性变阳性 常见的原 因有以下6点：, 加入试剂或样品时引起的交叉污染 （最好在加完所有其他反应成分，包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA，将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心10秒，使水相和有机相分开）。,加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染 （将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。, 打开标本管盖引起样品飞溅 （打开前须瞬间离心）操作时手套引起的交叉污染 （拿过模板DNA管后应更换手套）,不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染 （必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。实验室污染,3. PCR检测结果不稳定（1）样品处理方法不当，标本中杂质很多， 血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。 蛋白质DNA电泳带拖尾 血红素中的卟啉化合物抑制Taq酶活性 代谢产物干扰引物配对,（2）操作不当带来的后果 主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。 如HCV RNA PCR样品处理试剂A、B、C和75%乙醇的操作过程。,50l血清标本 ( 标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂， 避免反复冻融 )加200l试剂A后立即混匀 ( 试剂A是强烈的变性剂，不仅要将病毒外壳变性裂解，释放 核酸，而且要将样品中包含的其它蛋白（包括RNase）变性， 以避免蛋白进入PCR反应体系（RNase降解RNA模板），干 扰PCR扩增；混匀这一步至关重要，一定要振荡混合均匀才 能达到充分变性的结果。)加入试剂B（氯仿、异戊醇）50l混匀 （抽取变性剂及变性的蛋白，分离出核酸，同样必须充分 混匀，否则也会引起PCR检测失败 ),14 000r/min离心5