SNT5170-2019出口动物源食品中肾上腺素和去甲肾上腺素的测定

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 51702019 出口动物源食品中肾上腺素和去甲 肾上腺素的测定 Determination of adrenaline and noradrenaline in animal-origin foodstuffs for export 2019-10-25 发布2020-05-01 实施 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布 ICS 67.050 C 53 I SN / T 51702019 前 言 本标准按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国武汉海关、武汉食品化妆品检验所、湖北省食品质量安全监 督检验研究院。 本标准主要起草人：江小明、王鹏、叶诚、江丰、陈丹、赵晓亚、王晗、罗静、王振华、詹承勇。 1 SN / T 51702019 出口动物源食品中肾上腺素和去甲肾上腺素的测定 1 范围 本标准规定了出口动物源食品中肾上腺素、去甲肾上腺素残留量的液相色谱测定方法和液相色谱 - 质谱 / 质谱确证方法。 本标准适用于猪肉、牛肉、羊肉、牛奶、鸡蛋中肾上腺素、去甲肾上腺素残留量的测定，其他 食品也可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋中肾上腺素和去甲肾上腺素经焦性没食子酸 - 乙二胺四乙酸二钠溶 液提取，三氯甲烷去蛋白，乙腈饱和正己烷溶液除脂；牛奶用高氯酸溶液提取。试样用阳离子固 相萃取小柱净化后，经液相色谱仪测定，基质添加标准曲线外标法定量，阳性样品采用液相色谱 - 质谱 / 质谱仪进行定性确证。 4 试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 GB / T 6682 规定的一级水。 4.1 甲醇（CH3OH，CAS 号：67-56-1） ：色谱纯。 4.2 乙腈（CH3CN，CAS 号：75-05-8） ：色谱纯。 4.3 甲酸（HCOOH，CAS 号：64-18-6） ：色谱纯。 4.4 正己烷（C6H14，CAS 号：110-54-3） 。 4.5 三氯甲烷（CHCl3，CAS 号：67-66-3） 。 4.6 磷酸（H3PO4，CAS 号：7664-38-2） 。 4.7 高氯酸（HClO4，CAS 号：7601-90-3） ：含量 70%72%。 4.8 磷酸二氢钾（KH2PO4，CAS 号：7778-77-0） 。 4.9 乙酸铵（CH3COONH4，CAS 号：631-61-8） 。 4.10 焦性没食子酸（C6H6O3，CAS 号：87-66-1） 。 4.11 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8，CAS 号：139-33-3） 。 4.12 肾上腺素标准物质（C9H13O3N，CAS 号：51-42-3） ：纯度大于等于 95%。 4.13 去甲肾上腺素标准物质（C8H11NO3，CAS 号：51-41-2） ：纯度大于等于 95%。 4.14 高氯酸溶液（pH=2.00.2） ：吸取约 0.4 mL 高氯酸（4.7）至 1 L 水中，配制成 pH=2.00.2 的高氯酸水溶液。 4.15 试样提取液：准确称取 1.26 g 焦性没食子酸（4.10） 、1.86 g 乙二胺四乙酸二钠（4.11） ，加 2 SN / T 51702019 入 950 mL 水，加 50 mL 乙腈（4.2）混合均匀。 4.16 乙腈饱和正己烷：量取 80 mL 正己烷（4.4） 于 100 mL 分液漏斗中，加入适量乙腈（4.2） 后， 剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层即得。 4.17 磷酸二氢钾 - 磷酸水溶液（pH=4.0） ：准确称取 2.72 g 磷酸二氢钾（4.8） ，用水定容至 1 L， 用磷酸（4.6）调节 pH 至 4.0。 4.18 0.1% 甲酸甲醇溶液：准确移取 1 mL 甲酸（4.3） ，用甲醇（4.1）定容至 1 000 mL。 4.19 洗脱液：移取 2 mL 甲酸（4.3）加入 100 mL 的乙腈 - 水溶液（85 ： 15，体积比）中。 4.20 100 mmol / L 乙酸铵溶液：准确称取 3.85 g 乙酸铵（4.9） ，用水溶解，定容至 500 mL。 4.21 40 mmol / L 乙酸铵溶液：准确称取 1.54 g 乙酸铵（4.9） ，用水溶解，定容至 500 mL。 4.22 0.5 mmol / L 乙酸铵溶液：准确称取 0.038 5 g 乙酸铵（4.9） ，用水溶解，定容至 1 L。 4.23 标准储备液：准确称取适量的肾上腺素标准物质（4.12） 、去甲肾上腺素标准物质（4.13） ，均 精确至 0.000 1 g，用 0.1% 甲酸甲醇溶液（4.18）溶解，配制成浓度为 1 000 mg / L 的标准储备液，-18 条件下避光保存，有效期 3 个月。 4.24 混合标准中间溶液：分别准确移取 5.0 mL 肾上腺素、去甲肾上腺素的标准储备液（4.23）至 100 mL 棕色容量瓶中，用 0.1% 甲酸甲醇溶液（4.18）稀释至刻度，配制成浓度为 50.0 mg / L 的标准 中间溶液，于 -18 条件下避光保存，有效期 1 个月。 4.25 基质混合标准工作溶液：将混合标准中间溶液（4.24）用磷酸二氢钾 - 磷酸水溶液（4.17） 稀释成浓度为 2.50 mg / L50.0 mg / L 的标准系列溶液，称取与试样基质相应的阴性样品 5 g，加入 标准系列溶液 100 L，与试样同时进行提取和净化，得到浓度分别为 125 g / L2 500 g / L 的基质混 合标准工作溶液。 4.26 阳离子固相萃取（SPE）小柱：填料为 N- 乙烯基吡咯烷酮 - 二乙烯苯共聚物基质 -COOH 6 mL（150mg）或性能相当者。使用前依次用 6 mL 甲醇（4.1） 、6 mL 水对柱子进行活化。 4.27 微孔滤膜：通用型，0.22 m。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱仪：配荧光检测器。 5.2 液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配电喷雾离子源（ESI） 。 5.3 组织捣碎机。 5.4 涡旋混合器。 5.5 电子分析天平：感量为 0.000 1g 和 0.01g。 5.6 高速冷冻离心机：转速不低于 8 000 r / min。 5.7 氮气吹干仪。 5.8 pH 计。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 6.1.1 猪肉、牛肉、羊肉 猪肉、牛肉、羊肉各约 500 g，放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成 2 份，分别装入清 洁容器内，并标明标记。 3 SN / T 51702019 6.1.2 鸡蛋 取 16 枚新鲜鸡蛋（约 1 kg） ，洗净、去壳后充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容器内， 并标明标记。 6.1.3 牛奶 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温、摇匀，备用。 制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2 试样保存 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋试样于 -20 以下条件下保存；牛奶试样置于 0 4 条件 下保存。 7 测定步骤 7.1 提取 7.1.1 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋 称取试样 5 g （精确到 0.01 g）于 50 mL 具塞离心管中，加入 10 mL 试样提取液（4.15） ，涡 旋提取 1 min，加入 5 mL 三氯甲烷（4.5） ，涡旋混匀 30 s，以 8 000 r / min 的转速离心 10 min 后，取全部上清液于另一 50 mL 离心管中，加入 5 mL 乙腈饱和正己烷（4.16） ，涡旋混匀 30 s， 以 8 000 r / min 的转速离心 3 min，收集下层清液，用 100 mmol / L 乙酸铵溶液（4.20）定容到 25 mL，待净化。 7.1.2 牛奶 称取试样 5 g（精确到 0.01 g）于 50 mL 具塞离心管中，加入 20 mL 高氯酸溶液（4.14） ，静置 20 min，于 4 经涡旋提取 1 min，以 8 000 r / min 的转速离心 10 min，取出上清液，用 100 mmol / L 乙酸铵溶液（4.20）定容到 50 mL，待净化。 7.2 净化 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋样品取 7.1.1 中待净化溶液 12.5 mL 过 SPE 小柱 （4.26） ；牛奶样品取 7.1.2 待净化溶液 25 mL 过 SPE 小柱（4.26） 。控制流速为 1 mL / min2 mL / min，再依次用 5 mL 40 mmol / L 乙酸铵溶液（4.21） 和 5 mL 甲醇（4.1） 淋洗柱子，经真空抽干，用 5 mL 洗脱液（4.19） 洗脱，控制流速为 1 mL / min2 mL / min，收集洗脱液，用氮气吹至干，用磷酸二氢钾 - 磷酸水 溶液（4.17）定容至 1 mL，过 0.22 m 微孔滤膜（4.27） ，供液相色谱仪分析。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱条件 7.3.1.1 色谱柱：C18色谱柱，250 mm4.6 mm（内径） ，粒径 5.0 m 或性能相当者。 7.3.1.2 柱温：35 。 7.3.1.3 流动相：A 为磷酸二氢钾 - 磷酸水溶液（pH=4.0） （4.17） ，B 为甲醇（4.1） ，梯度洗脱， 梯度洗脱条件见表 1。 4 SN / T 51702019 表 1 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min流动相 A / %流动相 B / % 0973 5973 103565 153565 15.1973 7.3.1.4 柱流速：1 mL / min。 7.3.1.5 进样量：10 L。 7.3.1.6 检测器激发波长：285 nm。 7.3.1.7 发射波长：320 nm。 7.3.2 定量测定 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与基质混合标准工作溶液相比，变化范围应在 2.5% 之间。将基质混合标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱仪中，保留时间定性，测得待测物 峰面积。待测样液中肾上腺素、去甲肾上腺素的响应值均应在仪器检测的定量线性响应范围内。 肾上腺素、去甲肾上腺素的液相色谱图参见附录 A。 7.4 液相色谱 - 质谱 / 质谱确证 7.4.1 阳性样品的确证 对于液相色谱方法检出阳性的样品，采用液相色谱 - 质谱 / 质谱方法进行定性确证。 7.4.2 液相色谱条件 7.4.2.1 色谱柱：C18色谱柱，50 mm2.1 mm（内径） ，粒径 1.7 m 或性能相当者。 7.4.2.2 柱温：35 。 7.4.2.3 流动相：A 为 0.5 mmol / L 乙酸铵溶液（4.22） ，B 为 0.1 % 甲酸甲醇溶液（4.18） ，梯度 洗脱，梯度洗脱条件见表 2。 表 2 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min流动相 A / %流动相 B / % 09010 1.59010 5.51090 71090 109010 7.4.2.4 柱流速：0.25 mL / min。 7.4.2.5 进样量：10 L。 5 SN / T 51702019 7.4.3 质谱条件 7.4.3.1 离子源：电喷雾离子源（ESI） 。 7.4.3.2 扫描方式：正离子扫描。 7.4.3.3 检测方式：多反应监测模式（MRM） 。 7.4.3.4 监测离子对、定量离子对见表 3。 表 3 肾上腺素、去甲肾上腺素的监测离子对、定量离子对 被测物监测离子对（m / z）定量离子对（m / z） 肾上腺素 184.1 / 166.1 184.1 / 107 184.1 / 166.1 去甲肾上腺素 152.3 / 107 152.3 / 135 152.3 / 107 7.4.3.5 使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件参见附录 B。 7.4.4 定性测定 按照液相色谱 - 质谱 / 质谱条件测定试样和基质混合标准工作溶液，试样中目标化合物的保 留时间与基质混合标准工作溶液中对应化合物的保留时间偏差在 2.5% 之内；定性离子对的相 对丰度与浓度相当的基质混合标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 4 的规定， 且每个定性离子的信噪比均 3，则可判断试样中存在相应的被测物。在上述仪器条件下，肾上 腺素、去甲肾上腺素的提取离子色谱图参见附录 C。 表 4 定性离子对相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 / % 502050（含）1020（含） 10 允许的相对偏差 / %20253050 7.5 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。 8 结果计算和表述 采用基质匹配标准曲线定量，试样中肾上腺素、去甲肾上腺素的含量由液相色谱仪和液相色 谱 - 质谱 / 质谱仪的数据处理软件按式（1）计算，计算结果应扣除空白值。 c Vf X m = （1） 式中： X试样中被测组分的含量，单位为微克每千克（g / kg） ； c 从标准工作曲线得到的样液中被测组分浓度，单位为微克每升（g / L） ； V试样定容体积，单位为毫升（mL） ； f 试样的稀释倍数； 6 SN / T 51702019 m 试样称样量，单位为克（g） 。 注：计算结果以重复性条件下获得的 2 次独立测定结果的算术平均值表示，保留 3 位有效数字。 9 检出限、定量限和回收率 9.1 检出限和定量限 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋、牛奶中肾上腺素、去甲肾上腺素的检出限为 50.0 g / kg，定量限 为 100 g / kg。 9.2 回收率 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋、牛奶中肾上腺素、去甲肾上腺素的添加水平和回收率数据参见附 录 D。 7 SN / T 51702019 附 录 A （资料性附录） 去甲肾上腺素和肾上腺素标准物质的液相色谱图 图 A.1 去甲肾上腺素、肾上腺素标准物质的液相色谱图（1 000g / L） 注：去甲肾上腺素、肾上腺素标准品的保留时间分别为 2.525 min、2.930 min。 8 SN / T 51702019 附 录 B （资料性附录） a 质谱参考参数 1） B.1 离子源温度：150 。 B.2 毛细管电压：3 000 V。 B.3 脱溶剂气温度：500 。 B.4 脱溶剂气流速：800 L / h。 B.5 锥孔气流速：146 L / h。 B.6 肾上腺素、去甲肾上腺素的主要参考质谱参数见表 B.1。 1） 非商业性声明：本标准中所列参数是在 Waters TQ-S 质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供 参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号仪器。 表 B.1 肾上腺素、去甲肾上腺素的主要参考质谱参数 化合物名称母离子（m / z） 子离子（m / z）扫描模式锥孔电压（DP） / V碰撞气电压（CE） / eV 肾上腺素184.1 166.1* ESI+25 8 10718 去甲肾上腺素152.3 107* ESI+25 15 13510 注：* 表示定量离子对。 9 SN / T 51702019 附 录 C （资料性附录） 标准物质的提取离子色谱图 图 C.1 肾上腺素标准溶液的提取离子色谱图（50 g / L） 图 C.2 去甲肾上腺素标准溶液的提取离子色谱图（50 g / L） a） a） b） b） 10 SN / T 51702019 附 录 D （资料性附录） 添加水平及回收率数据 表 D.1 肾上腺素和去甲肾上腺素在猪肉中的添加水平及其回收率 化合物添加浓度 / （g / kg）回收率范围 / %相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010281.4108.011.5 2.0010280.792.34.8 1.0010382.9107.210.1 去甲肾上腺素 1.0010285.9107.48.8 2.0010286.3105.67.0 1.0010382.4106.79.1 表 D.2 肾上腺素和去甲肾上腺素在牛肉中的添加水平及其回收率 化合物添加浓度 / （g / kg）回收率范围 / %相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010285.2103.78.3 2.0010280.3108.011.2 1.0010384.5107.28.5 去甲肾上腺素 1.0010282.8104.58.6 2.0010282.7104.28.8 1.0010380.298.36.8 表 D.3 肾上腺素和去甲肾上腺素在羊肉中的添加水平及其回收率 化合物添加浓度 / （g / kg）回收率范围 / %相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010282.3106.29.1 2.0010281.3108.412.1 1.0010386.3104.57.0 去甲肾上腺素 1.0010291.9106.65.5 2.0010280.397.48.6 1.0010392.2107.76.2 11 SN / T 51702019 表 D.4 肾上腺素和去甲肾上腺素在牛奶中的添加水平及其回收率 化合物添加浓度 / （g / kg）回收率范围 / %相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010283.8103.77.9 2.0010288.8105.26.9 1.0010381.1106.410.0 去甲肾上腺素 1.0010281.8103.28.7 2.0010289.5107.1 7.0 1.0010383.1103.38.2 表 D.5 肾上腺素和去甲肾上腺素在鸡蛋中的添加水平及其回收率 化合物添加浓度 / （g / kg）回收率范围 / %相对标准偏差 / % 肾上腺素 1.0010287.7108.19.3 2.0010283.9109.39.5 1.0010388.7102.05.6 去甲肾上腺素 1.0010287.3108.17.3 2.0010283.0108.812.2 1.0010380.497.17.3 13 SN / T 51702019 Foreword This standard was drafted according to GB / T 1.12009. This standard was proposed by and under the charge of General Administration of Customs, P. R. China. This standard was drafted by Wuhan Customs District P. R. China, Wuhan Institute for Food and Cosmetic Control, Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test. This standard was mainly drafted by Jiang Xiaoming, Wang Peng, Ye Cheng, Jiang Feng, Chen Dan, Zhao Xiaoya, Wang Han, Luo Jing, Wang Zhenhua, Zhan Chengyong. 15 SN / T 51702019 Determination of adrenaline and noradrenaline in animal-origin foodstuffs for export 1 Scope This standard specifies the method of determination of adrenaline and noradrenaline in animal-origin foodstuffs for exportLC and LC-MS / MS. This standard is applicable to the determination of adrenaline and noradrenaline residues in pork, beef, mutton, eggs and milk for export. Other foods may be also tested by consulting this standard. 2 Normative references The following documents are necessary for this standard. For dated reference， only dated editions shall apply to this standard. For undated reference， the latest edition of the normative document （including subsequent amendments） referred to applies. GB / T 6682 Water for analytical laboratory use-Specification and test methods 3 Principle The contents of adrenaline and noradrenaline in pork, beef, mutton and eggs are extracted by pyrogallic acid- EDTA-2Na solution ,chloroform deproteinated and acetonitrile-saturated n-Hexane degreased. The contents of adrenaline and noradrenaline in milk are extracted by perchloric acid. Thereafter being cleaned up by cationic solid phase extraction cartridge, the contents are determined by LC, quantified by external standard method, and the positive sample is qualitatively confirmed by LC-MS / MS. 4 Reagents and materials Unless otherwise specified, all reagents used should be of analytically pure， “water” is the first grade water prescribed by GB / T 6682. 4.1 Methanol（CH3OH, CAS No. ： 67-56-1） ： chromatography pure. 4.2 Acetonitrile （CH3CN, CAS No. ： 75-05-8） ： chromatography pure. 4.3 Formic acid （HCOOH, CAS No. ： 64-18-6） ： chromatography pure. 4.4 N-Hexane（C6H14, CAS No. ： 110-54-3）. 4.5 Chloroform（CHCl3, CAS No. ： 67-66-3）. 4.6 Phosphoric acid（H3PO4, CAS No. ： 7664-38-2） . 4.7 Perchloric acid（HClO4, CAS No. ： 7601-90-3）: 70%72%. 4.8 Potassium dihydrogen phosphate（KH2PO4, CAS No. ： 7778-77-0）. 4.9 Ammonium acetate（CH3COONH4, CAS No. ： 631-61-8）. 4.10 Pyrogallic acid（C6H6O3，CAS No. ： 87-66-1）. 16 SN / T 51702019 4.11 EDTA-2Na（C10H14N2Na2O8，CAS No. ： 139-33-3） . 4.12 Standard substance of adrenaline（C9H13O3N， CAS No. ： 51-42-3） ： purity 95%. 4.13 Standard substance of noradrenaline（C8H11NO3, CAS No. ： 51-41-2） ： purity 95%. 4.14 Perchloric acid solution（pH=2.00.2）: pipette about 0.4 mL perchloric acid（4.7）and dissolve in 1 L water, adjust the pH to 2.00.2. 4.15 Extracting solution: weigh 1.26 g pyrogallic acid（4.10）, 1.86 g EDTA-2Na （4.11） and dissolve in 950 mL water, add 50 mL acetonitrile（4.2） , mix to homogenous. 4.16 Acetonitrile-saturated n-Hexane ： measure 80 mL of n-Hexane （4.4） in a 100 mL separatory funnel, add appropriate amount of acetonitrile （4.2）, shake vigorously, and after equilibration, discard the acetonitrile layer. 4.17 Potassium dihydrogen phosphate-phosphoric acid solution（pH=4.0） ： accurately weigh 2.72 g of potassium dihydrogen phosphate （4.8）, dilute to 1 L with water, and adjust pH to 4.0 with phosphoric acid （4.6）. 4.18 0.1% formic acid-methanol solution： accurately pipette 1 mL formic acid（4.3） dilute to 1L with methanol（4.1）. 4.19 Eluent ： pipette 2 mL of formic acid （4.3） into 100 mL acetonitrile-water solution（acetonitrile : water =85 : 15）. 4.20 100 mmol / L ammonium acetate solution ： weigh 3.85 g ammonium acetate （4.9）accurately and dilute to 500 mL with water. 4.21 40 mmol / L ammonium acetate solution ： weigh 1.54 g ammonium acetate （4.9）accurately and dilute to 500 mL with water. 4.22 0.5 mmol / L ammonium acetate solution: weigh 0.038 5 g ammonium acetate （4.9）accurately and dilute to 1 L with water. 4.23 Standard stock solution: weigh appropriate standard substance of adrenaline（4.12）and noradrenaline （4.13）accurately and dissolve with 0.1% formic acid-methanol solution （4.18） . The concentration of the solution is 1 000 mg / L . The stock solution should be stored at -18 refrigerator in dark. The term of validity is 3 months. 4.24 Mixed standard intermediate solution: pipette 5.0 mL of standard stock solution（4.23） into 100 mL brown volumetric flask, dilute to the mark with 0.1% formic acid-methanol solution （4.18） . The concentration of the solution is 50.0 mg / L. The intermediate solution should be stored at -18 refrigerator in dark. The term of validity is 1 month. 4.25 Matrix mixed standard working solution: dilute the mixed standard intermediate solution （4.24） with potassium dihydrogen phosphate-phosphoric acid solution （4.17） to a standard series solution of 2.50 mg / L to 50.0 mg / L. Weigh negative sample corresponding to the sample matrix 5 g, add 100 L of the standard series solution, extractand purify to obtain a matrix mixed standard working solution with concentration of 125 g / L to 2 500 g / L. 4.26 Cationic solid phase extraction cartridge: the filler is N-vinylpyrrolidone-divinylbenzene copolymer matrix-COOH 6 mL（150 mg）, or equivalent. The column is activated with 6 mL of methanol （4.1） and 6 mL of water before use. 4.27 Membrane: generic, 0.22 m. 5 Apparatus and equipment 5.1 Liquid chromatograph: equipped with a fluorescence detector. 5.2 High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: equipped with electrospray ionization source （ESI）. 17 SN / T 51702019 5.3 Tissue blender. 5.4 Vortex mixer. 5.5 Analytical balance: accurate to 0.000 1g and 0.01g. 5.6 Refrigerated centrifuge: higher than 8 000 r / min. 5.7 Nitrogen evaporator. 5.8 pH Meter. 6 Sample preparation and storage 6.1 Preparation of test sample 6.1.1 Pork, beef, mutton Take approximately 500 g of representative sample of pork, beef or mutton in a tissue blender, mix thoroughly, divide into two portions and placed into a clean container, sealed and labeled. 6.1.2 Eggs Take the edible part for 16 eggs（approximately 1 000 g）blended in a tissue blender, mix thoroughly, divide into two portions and placed into a clean container， sealed and labeled. 6.1.3 Milk Warm the milk sample to room temperature, mix thoroughly. In the course of sampling and sample preparation, precautions must be taken to avoid the contamination or any factors which may cause the change of residue content. 6.2 Storage of test sample The sample of pork, beef, mutton and eggs should be stored below -20 . The sample of milk should be stored at 0 4 . 7 Procedure 7.1 Extraction 7.1.1 Pork, beef, mutton, eggs Weigh 5 g of the test sample （accurate to 0.01 g） into a 50 mL stoppered centrifuge tube. Add 10 mL extracting solution （4.15）, vortex for 1 min. Add 5 mL chloroform （4.5）, mix intensely and vortex for 30 s. Then centrifuge for 10 min at 8 000 r / min. Transfer all the supernatant to another 50 mL centrifuge tube, add 5 mL acetonitrile-saturated n-Hexane （4.16）, mix intensely and vortex for 30 s, centrifuge for 3 min at 8 000 r / min, collect the subnatant, and dilute to 25 mL with 100 mmol / L ammonium acetate solution （4.20）. 7.1.2 Milk Weigh 5 g of the test sample （accurate to 0.01 g） into a 50 mL stoppered centrifuge tube, add 20 mL perchloric acid solution（4.14） with standing for 20 min, extract with vibrating for 1 min at 4 . Then centrifuge for 10 min at 8 000 r / min. Collect the supernatant, and dilute to 50 mL with 100 mmol / L ammonium acetate solution （4.20）. 18 SN / T 51702019 7.2 Cleanup Take 12.5 mL of the solution in 7.1.1 of pork, beef, mutton, and eggs samples into the SPE cartridge （4.26）. Take 25 mL of the solution in 7.1.2 of the milk sample into the SPE cartridge （4.26）. Control the flow rate at 1 mL / min2 mL / min, then rinse the column with 5 mL 40 mmol / L ammonium acetate solution （4.21） and 5 mL methanol （4.1）, vacuum-dried, elute with 5 mL eluent （4.19） , control the flow rate at 1 mL / min2 mL / min. Collect the eluent, blow to dryness by a nitrogen evaporator. Dissolve the residue with 1.0 mL potassium dihydrogen phosphate-phosphoric acid solution （4.17） . After being filtrated with a 0.22 m generic membrane（4.27）, the final solution is ready for analysis by LC. 7.3 Determination 7.3.1 LC operating conditions 7.3.1.1 LC column: C18 LC column（250 mm 4.6 mm i.d.） , 5.0 m or equivalent. 7.3.1.2 Column temperature: 35 . 7.3.1.3 Mobile phase: A is potassium dihydrogen phosphate-phosphoric acid solution（pH=4.0） （4.17）, B is methanol（4.1） ，the grade of mobile phase is listed in table 1. Table 1 Grade of mobile phase Time / minA / %B / % 0973 5973 103565 153565 15.1973 7.3.1.4 Flow rate: 1 mL / min. 7.3.1.5 Injection volume: 10 L. 7.3.1.6 The excitation wave length ： 285 nm. 7.3.1.7 The fluorescence emission wave length ： 320 nm. 7.3.2 Quantitation determination The retention time of the compound peak in the sample to be tested should be within 2.5% compared to the standard solution. The matrix mixed standard working solution and the sample solution are sequentially injected into the LC, and the retention time is qualitatively determined, and the peak area of the analyte is measured. The response values of adrenaline and noradrenaline in the sample to be tested should be within the quantitative linear range of the instrument. The liquid chromatograms of adrenaline and noradrenaline are showed in annex A. 7.4 LC-MS / MS Confirmation 7.4.1 The confirmation of the positive samples The positive samples are qualitatively confirmed by LC-MS / MS. 19 SN / T 51702019 7.4.2 LC operating conditions 7.4.2.1 LC column: C18 LC column（50 mm 2.1 mm i.d.） , 1.7 m or equivalent. 7.4.2.2 Column temperature: 35 . 7.4.2.3 Mobile phase: A is 0.5 mmol / L ammonium acetate solution （4.22）, B is 0.1% formic acid-methanol solution（4.18） ，the grade of mobile phase is listed in table 2. Table 2 Grade of mobile phase Time / minA / %B / % 09010 1.59010 5.51090 71090 109010 7.4.2.4 Flow rate: 0.25 m