[医学]7细菌及病毒的遗传作图.ppt

Chapter7细菌及病毒的遗传作图,本章要求7.1细菌和病毒遗传研究的意义7.2病毒的一般特性及类型7.3噬菌体的染色体作图7.4细菌的细胞和染色体结构7.5细菌的染色体作图,理解细菌和病毒在遗传研究中的优越性和意义；掌握转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；掌握F-菌株、F+菌株、Hfr菌株的概念、区别和用途；区别F因子、F因子的异同；了解温和性噬菌体、烈性噬菌体的生活周期；掌握原噬菌体、溶源性细菌的概念；了解细菌和病毒遗传作图的原理和基本过程。,本章要求,7.1细菌和病毒遗传研究的意义,7.1.1细菌的培养7.1.2细菌在生物进化树中的地位7.1.3细菌和病毒在遗传研究中的优越性7.1.4细菌和病毒的拟有性过程,7.1.1细菌培养,平皿培养,7.1.2细菌在生物进化树中的地位,7.1.3细菌和病毒在遗传研究中的优越性,繁殖世代所需时间短。每个世代以分钟或小时计，如大肠杆菌每20分钟即可繁殖一代。易于管理和进行化学分析。用一支试管就可贮存数以百万计的细菌或病毒，在短期内累积大量产物，为化学分析提供条件。遗传物质较简单。只有一个位于细胞质内裸露的DNA或RNA分子。,便于研究基因的突变。细菌和病毒属于一倍体，所有突变都能立即表现出来。便于研究基因的作用。细菌可以生活在基本培养基上，易于获得营养缺陷型，也易于测知各种营养缺陷型所需要的物质，是研究基因作用的好材料。可作为研究高等生物的简单模型。可以从微生物的研究中得到模型，并从中获得启发，为开展对高等生物的的遗传研究开拓思路。,7.1.4细菌和病毒的拟有性过程,真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过程(减数分裂受精)实现。细菌和病毒均属于原核生物，不存在严格意义上的有性过程。细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子（如噬菌体和质粒），或叫核外或染色体外因子，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体。这种重组体结构类似于真核生物减数分裂过程中形成的重组体结构。拟有性过程引起细菌、病毒间遗传物质转移与重组的过程。拟有性过程是细菌、病毒在遗传学研究，特别是作为真核生物的模型研究遗传重组和基因结构的重要前提。,7.2病毒的一般特性及类型,7.2.1病毒的一般特性7.2.2病毒的类型7.2.3噬菌体的生活周期,7.2.1病毒的一般特性,无细胞结构；为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒。形体极微小；只有在电子显微镜下才能观察到。化学组成简单；主要是核酸和蛋白质。只含一种核酸（DNA或RNA）。缺乏独立代谢能力（依赖宿主)。繁殖方式独特；只能依赖宿主活细胞的代谢机制，通过核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒颗粒的方式进行繁殖。具有双重存在方式；或营专性寄生在活细胞内，或在细胞外以大分子颗粒状态进行传播。对干扰素敏感，而对抗生素不敏感。,7.2.2病毒的类型,根据宿主来划分：细菌病毒:一般称为噬菌体（phage）植物病毒无脊椎动物病毒脊椎动物病毒亚病毒:类病毒、拟病毒、朊病毒,类病毒：一个单链环状的裸露的RNA。拟病毒：线状单链RNA环状单链RNA。朊病毒：蛋白质颗粒。,7.2.3噬菌体的生活周期,烈性噬菌体（virulentphage）噬菌体侵入宿主细胞后，利用宿主细胞内的物质进行自身遗传物质和蛋白质的合成，组装出许多子噬菌体，使宿主细胞裂解而释放子噬菌体，这类噬菌体称为烈性噬菌体。裂解周期：吸附侵入核酸的复制、转录与蛋白质的生物合成装配释放,温和性噬菌体（temperatephage）原噬菌体（prophage）某些噬菌体侵染细菌后，其DNA整合到宿主染色体中，这种处于整合状态的噬菌体称为原噬菌体。溶源性细菌（lysogenicbacteria）含有原噬菌体的宿主细菌称为溶源性细菌，或溶源体。温和性噬菌体在噬菌体侵入后，细菌并不裂解，而是以原噬菌体或质粒的形式存在的一类噬菌体称为温和性噬菌体。原噬菌体通过诱导（induction）可转变为烈性噬菌体。诱导方式有多种，如温度改变、与非溶源性细菌的接合等。,7.3噬菌体的染色体作图,7.3.1T2噬菌体的基因重组与作图7.3.2噬菌体的基因重组与作图7.3.3基因的细微结构作图7.3.4互补测验和顺反测验,7.3.1T2噬菌体的基因重组与作图,噬菌体遗传性状可分为噬菌斑的形态宿主范围（1）噬菌斑突变：T噬菌体的r-突变体正常噬菌体，r+，产生的菌斑小而边缘模糊突变噬菌体，r-，产生的菌斑大两倍而边缘清晰（2）宿主范围突变：T噬菌体的h-突变体大肠杆菌B株是T2的宿主，大肠杆菌B/2株对T2产生抗性一种发生在T2上的h-突变体，能利用B和B/2株而h+只能利用B株,将两种不同的T2突变体进行杂交，对其杂交子代进行重组分析杂交方法：将B和B/2两种大肠杆菌细胞混合同时接种高浓度的T2噬菌体的h-r+和h+r-两种突变体，保证绝大多数细菌都被一个以上噬菌体感染两种不同的噬菌体DNA可能在宿主细胞内进行重组，从而产生非亲本型子代h+r+和h-r-。亲本型重组型,由于不同速溶性噬菌体的突变体在表型上不同，可分别写成ra、rb、rc等。用rxh+r+h-可对其进行基因定位。,7.3.1T2噬菌体的基因重组与作图,由rxh+r+h-实验结果（表7-1，P137）可知Rfra-h=24%Rfrb-h=12.3%Rfrc-h=1.6%，据重组值可知3个r基因和h基因的排列方式有rarbrchrarchrbrarbhrcrahrcrb又rc-rb+rc+rb-Rfrc-rb=14%h位于rb和rc之间。（中间两种情况都有可能，哪一个对呢？）,7.3.2噬菌体的基因重组与作图,凯泽（Kaiser，1955）用UV照射处理噬菌体，得到5个噬菌体的突变系：S小噬菌斑mi微小噬菌斑C完全清亮的噬菌斑C01除中央一个环其余部分都清亮的噬菌斑C02比C01更浓密的中央环噬菌斑,SC01mi+975SC01mi924S+30+C01mi32SC01+61+mi51S+mi5+C01+13总数2091,Rfs-co1=3.76%Rfs-mi=6.16%Rfco1-mi=9.92%负干扰：在噬菌体的三点测验中发现一个单交换发生后，会增加另一个单交换发生的概率，这时干扰系数为负值，这种现象称为负干扰。,1,7.3.3基因的细微结构作图：,1、T4噬菌体r区的作图将T4噬菌体r区的两个不同突变型r1和r2杂交：r1+亲本型：r1+和+r2（B菌株上产生突变型、K菌株上不长）+r2重组型：+（B菌株和K菌株上都产生野生型）和r1r2（B菌株上产生突变型、K菌株上不长）,基因内不同位点的突变会产生不同的突变等位基因，从而产生不同的类型。将这些不同的突变体杂交，会发生基因内重组，可以计算出基因内重组的相对频率，从而确定基因内各突变位点的排列顺序和相对位置，即基因的细微结构作图。,2、缺失作图将突变体进行初步筛选的方法：判断突变发生的区域。缺失：基因或染色体片段的丢失。只能与a区中的突变体杂交才能产生野生型重组体只能与c区中的突变体杂交才能产生野生型重组体abc与两者都不能产生野生型重组体的突变体位于b区例（p141图7-13）,7.3.4互补测验和顺反测验,互补作用：两个突变型细胞的两条同源染色体同处在一个杂合体细胞或局部合子时（二倍体或部分二倍体），野生型基因补偿突变基因的缺陷而使细胞的表型恢复正常的作用。否则，两种突变型一定具有相同功能(相同基因）损伤。属于同一基因的两个突变不能互补，互补通常发生在不同基因之间的突变。顺反/互补测验：通过比较顺式和反式构型细胞的表型从而判断影响某一表型的2个突变是属于等位基因内突变还是属于非等位基因间突变的测验。,一对同源染色体上两个突变发生在同一条染色体上，基因型为AB/-时称为顺式构型；若发生在两条染色体上，基因型为A-/-B时称为反式构型。测验时，如果顺式为野生型，而反式为突变型，则这两突变发生在同一基因的不同位置；如果顺式和反式都为野生型，则这两突变分别发生在两个基因内。,7.4细菌的细胞和染色体结构,7.4.1形态特征7.4.2细菌细胞结构的特点7.4.3细菌DNA与质粒7.4.4细菌遗传的实验研究方法,7.4.1形态特征,细菌是单细胞生物，细胞结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质和核区，部分细菌还有某些特殊结构，如鞭毛、伞毛、荚膜、芽胞、气泡等；,生活周期短，易培养；易获得其生化突变型；大小不一，形态各异。常见细菌的形状有杆状、球状和螺旋状，其中以杆状最常见。,7.4.2细菌细胞结构的特点,无真正的细胞核。细菌细胞只在菌体中央有一个遗传物质集中区核区，无核膜和核仁，其功能与细胞核相当，由一个环状DNA分子高度缠绕而成，其中央部分还有RNA与支架蛋白，这样的核区称为拟核。缺乏线粒体、叶绿体、内质网、GC等细胞器。,7.4.3细菌DNA与质粒,细菌DNA：是一个很长的共价闭合环状双链分子（dsDNA），通常以超螺线体的形式存在于细菌体内。细菌无典型的染色体结构，没有组蛋白与DNA分子结合，DNA仅与一些碱性蛋白相结合。细菌DNA中有一定比例（约1%）的碱基被甲基化，其中以腺嘌呤居多，胞嘧啶次之。细菌的遗传物质比较简单，适宜用作基因结构和功能的研究。,质粒：细菌体内含有的一种染色体外的小型环状DNA。质粒实质上是一些携带着决定细菌某些遗传特性的基因，如抗药、产毒、致病、形成芽胞、产生色素或抗生素等的基因。质粒能独立于染色体存在和复制，还能在细胞间传递。附加体：有些质粒能整合到细菌染色体中，在染色体的控制下随染色体一起复制，这类质粒称为附加体（episome）。,7.4.4细菌遗传的实验研究方法,培养基的类型：基本培养基（野生型）完全培养基（突变型）选择培养基（鉴定突变类型）补充培养基（具体突变类型的确定）,细胞计数(培养物细胞浓度)建立纯系的方法选择培养法鉴定突变型与重组型突变型与重组型的批量筛选方法,细胞计数(培养物细胞浓度),培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实验技术，其基本思路是：对原培养物进行连续稀释；进行平板涂抹培养；由于一个细胞形成一个菌落，计数菌落数；根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。,Resultsoftheserialdilutiontechniqueandsubsequentcultureofbacteria,建立纯系的方法纯培养,纯系：由单个细胞繁殖而来的菌落称为纯系。菌种纯：采用平板表面涂布法或划线法获得单株菌落。这种方法获得的纯系，称为“菌种纯”。菌株纯：利用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法获得单个细胞，并直接培养建立纯系，这种方法获得的纯系称为“菌株纯”。,选择培养法鉴定突变型与重组型,许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件有关。营养缺陷型的筛选、鉴定选择培养法。是根据菌株在基本培养基和营养培养基上的生长表现差异将菌株分为原养型(在基本培养基上能正常生长)与营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长)，该方法一次只能检出一种突变型。其它突变类型的筛选、鉴定对于其它的突变类型(如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。,选择培养法的缺点：效率不高：一次可鉴定、筛选一种突变型影印培养法：黎德伯格夫妇为高效检测、分离混和群体不同突变型设计了影印培养法，该方法原理与选择培养法一致采用影印法将完全培养基上的单菌落同时接种到不同选择培养基上，同时对所有菌落进行选择，提高鉴定效率注意：最初的培养基必须是完全培养基，各种突变型都能够生长模板接种时必须采用适当的方法如涂布或划线法，使培养物菌落之间分开,突变型与重组型的批量筛选方法,影印培养法（Lederberg,1952）,7.5细菌的染色体作图,7.5.1接合（conjugation)7.5.2转化(transformation)7.5.3性导(sexduction)7.5.4转导(transduction),一个细菌细胞的DNA与另一个细菌细胞的DNA的交换与重组可以通过四种方式进行：,7.5.1接合,接合现象的发现和证实F因子及其在杂交中的行为中断杂交实验作图,接合现象的发现和证实,1946年，J.Lederberg&E.Tatum的大肠杆菌杂交试验：材料：大肠杆菌(Escherichiacoli)K12菌株的两个营养缺陷型品系：菌株A甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-；菌株B苏氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。方法：将A、B两菌株混和，在基本培养基(固体)上涂布培养。结果：平板上长出原养型菌落(+)。,上述试验获得的原养型菌落可能产生于：亲本菌株A或B发生了回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料互养作用；两品系间发生了转化作用；发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。,结果分析,回复突变可能的排除,Lederbery和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。因为：单基因回复突变的频率约为10-6；双基因回复突变的频率则为10-12，频率很低。但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高（10-7），因此基本可以排除回复突变的可能。,互养作用及其排除,试验材料A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。试验方法：将A、B品系混合接种在基本培养基表面，短时间后喷噬菌体T1杀死A品系，使其不能持续产生thr与leu供B品系持续生长。结果：仍然出现原养型菌落。结论：表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。,转化作用及其排除,Lederbery和Tatum曾把品系A的培养液经加热灭菌，加入到B品系的培养物中，未得到原养型菌落，表明原养型菌落可能不是由转化作用产生。戴维斯(Dawis,1950)的U型管试验：结果也没有得到原养型细菌。结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件，从而否定了转化的可能性。,异核体和杂合二倍体的可能性,若细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这两种情况类似于二倍体生物的杂合体,将产生原养型菌落。异核体：指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两个或多个细胞核。双杂合二倍体：是指异核体进一步发生核融合，形成二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存。培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落，对试验中得到的原养型菌落后代研究表明，后代没有出现预期的性状分离现象。,W.Hayes的实验（1952）,链霉素处理A菌完全培养基培养一段时间洗涤离心B菌重组体未减少基本培养基,链霉素处理B菌完全培养基培养一段时间洗涤离心A菌无重组体产生基本培养基,该实验说明细菌接合过程中遗传物质的转移是单向的，即遗传物质从A株转移到了B株。,接合现象的发现和证实,Hayes(1952)研究表明：大肠杆菌两种不同菌株(品系)接合过程中遗传物质的转移是单向的，从而认为大肠杆菌存在两种类型：雌性与雄性，分别作为接合过程中遗传物质的受体与供体。经过上述分析可以认为：在Lederbery和Tatum及其它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为接合。接合(conjugation)：指通过细胞间的直接接触将遗传物质从供体(donor)转移到受体(receptor)的重组过程。,Hayes等进一步研究发现，大肠杆菌在接合中作供体的能力受细胞内一种致育因子(性因子)，即F因子控制。F因子的化学本质是DNA分子，可以以自主状态存在于细胞质中或整合到细菌的染色体上。F因子可在细菌细胞间进行转移。,F因子与细菌结构、生理差异,F因子及其在杂交中的行为,致育因子：决定细菌雄性的是染色体外的一个共价环状DNA分子，称为致育因子（fertilityfactor），又称为F因子或F质粒。供体菌（雄性菌）：含有F因子的细菌，F因子游离于宿主染色体外，记为F+。受体菌（雌性菌）：不含有F因子的细菌，记为F。Hfr菌株（高频重组菌株）：指F因子整合到宿主染色体中的菌株，其重组频率比F+高1000多倍。,F因子的存在状态,性伞毛形成结合桥，进而诱导F因子上traYz基因表达，产生核酸内切酶，该酶在oriT转移起始点处一条单链上切开一个口，供体DNA以单链从5末端开始向受体转移，两条单链分别复制后受体内质粒DNA环化。F因子在宿主染色体上有许多特定的插入位点和方向，整合频率为每代10-510-7。接合过程：细菌间接触接合管形成单链断裂单链DNA从供体向受体转移单链复制DNA双链形成部分二倍体重组交换（偶数次交换）。,FF-,HfrF-,F与F-接合,F因子的特点,F细菌可以把F因子传给后代。F细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后不再出现。F可以和F杂交，而不能和F杂交。F和F杂交后代皆为F，而且可以以107频率获得重组体后代。,Hfr与F-接合,奇偶次交换,Hfr品系与F菌株的异同,相同都能和F杂交。杂交都要通过接合管和受体菌相联接。高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。不同产生重组子频率不同，HfrF104，FF107。FF后代F，HfrF后代F。F细菌经吖啶橙处理变成F，Hfr经吖啶橙处理仍为Hfr。,中断杂交实验1957年E.Wollman和E.Jacob设计完成将对链霉素敏感的Hfr菌株与对链霉素有抗性的F-菌株混合培养，每隔一段时间间隔取样，然后剧烈震荡以中断杂交，分开已经紧密接合的供体和受体杂交对。然后将震荡后的培养物接种到含链霉素的完全培养基，杀死所有Hfr细菌，以选择含有供体基因的抗链霉素受体细菌。对形成菌落的F-细胞用影印培养法测定基因型。该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间为位，求基因间的遗传距离。,中断杂交实验作图(巴斯德实验室，ElieWolliman和FrancoisJacob),1分钟20%的重组值,+,直接计算ade与lac之间的重组值,7.5.2转化,转化（transformation）：指某些细菌（或其它生物）能通过其细胞膜摄取周围介质中的DNA片段，并将此外源DNA片段整合到自己染色体组中的过程。,整合：供体单链DNA进入受体细胞后与受体染色体的某一部分联会，并进一步置换受体的对应染色体区段的过程。实例转化的过程转化在遗传分析中的应用,基础知识野生型肺炎双球菌菌落为光滑型，一种突变型为粗糙型，两者根本差异在于荚膜形成荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不发生互变,Griffith转化研究(1928),Griffith对其试验结论及发展,根据上述研究结果Griffith认为：(有毒)死细菌中的某种物质转移到(无毒)活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡将这种细菌遗传类型的转变称为转化，并将引起转化的物质称为转化因子(tranformingprinciple)但是当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌中的确切成分，因而不能确定转化因子为何物以后一些研究者重复上述试验，并且加入了体外培养试验，即：将加热杀死的SIII细菌与无毒RII细菌混合培养，然后注入小家鼠体内，同样导致家鼠死亡。表明：细菌在培养条件下也能够实现遗传类型间的定向转化,Avery的转化实验(1944),实验结论,上述实验结果表明：来源于加热杀死的SIII细菌，并使RII细菌转化成为SIII型细菌的转化因子是DNA正是在这一认识的基础上，将转化定义为：某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。Avery等人的实验实际上也表明：决定细菌遗传类型的物质是DNA，即证明了DNA就是遗传物质但由于他们采用的实验方法当时不被人们广泛接受，而且得出的结论与当时人们的传统观念不符合，而长期没有得到人们的承认。,转化过程,转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个方面的特征，即：感受态与感受态因子：感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用Ca2+(如Call2)处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力,供体(donor)DNA与受体(receptor)细胞结合(binding)：结合发生在受体细胞特定部位(结合点)对供体DNA片段有一定要求结合是一个可逆过程DNA摄取：当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源DNA往往只有一条14kbDNA单链进入细胞(单链摄入)，另一条链在膜上降解联会(synapsis)与外源DNA片段整合(integration)：整合指单链转化DNA与受体DNA对应位点置换，稳定掺入到受体DNA中的过程，实际上就是遗传重组过程研究整合的分子机制也就是研究遗传重组的分子机制,转染：用除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程称为转染。,利用两基因双转化(共转化)绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：相邻基因双转化频率与基因间距离成反比双转化产物为转化产物中供体亲本类型基因间距离越近，发生双转化的频率越高重组类型频率与基因间距离成正比重组类型即为单转化产物基因间距离越近，之间发生交换的概率越低,转化在遗传分析中的应用,双转化：供体的两个基因紧密连锁在一条DNA片段上，它们同时转化的现象称为双转化。两个基因双转化的效率基因定位（遗传作图）trp2+his2+tyr1+trp2-his2-tyr1-,转化在遗传分析中的应用,+,+,+,连锁遗传图,F因子：Hfr菌株在切除F因子时发生错误切除，分离出一个携带F因子和部分宿主染色体基因的遗传因子，这种带有宿主染色体基因的F因子称为F因子。性导(sexduction)：带有F因子的细菌在接合时，由F因子所携带的外源DNA便转移到宿主细菌的染色体上，这一过程称为性导。,7.5.3性导,F因子的转移（性导）,F因子使细菌重组的特点F因子以极高的比率转移它携带的基因；如同F+高效转移F因子一样。F因子有极高的自然整合率，而且整合在一定的基因座位上，因有与细菌同源的染色体区段，不同于F因子具有多个整合为点插入。F因子的用途不同的F因子带有不同的细菌DNA片段，可覆盖全部染色体基因，可用于构建部分二倍体菌株，用来研究基因的相互作用，确定显隐性关系，构建遗传图谱，进行互补测验以鉴定两个突变是属于一个基因还是两个基因等。,F，Hfr，F的接合对照,F+细胞：F因子自身可以高效转移，但对供体细菌基因转移的很少。Hfr细胞：对完整F因子的转移频率很低，而对供体细菌基因转移的效率很高，但能在受体细胞里发生重组的频率要低些，因为线性的供体染色体要经过偶数次交换才能重组进受体的染色体中形成稳定的环状DNA。F细胞：对含有少量