三维设计高中生物选修③---第一讲--基因工程(徐州-生物杜老师)剖析.ppt

,1.基因工程的工具(1)DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,(2)载体具备条件：a对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。b具标记基因。能对重组DNA是否进入受体细胞进行鉴定。c能自我复制。通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。d具有一个或多个限制酶切点，供外源基因插入其中。常用载体质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌染色体DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。,2.基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取途径直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。人工合成目的基因常用的方法有：a已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。b以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。c利用PCR技术获得。,PCR技术与DNA复制的比较,(2)基因表达载体的构建重组质粒的构建表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。基因表达载体的构建,(3)将目的基因导入受体细胞转化,受体种类不同，导入方法不同,植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法动物：显微注射法微生物：感受态细胞法,受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。植物：可以是卵细胞(受精卵)、体细胞(可经组织培养成为完整个体)。动物：受精卵(因为体细胞的全能性受到限制)。转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。,(4)目的基因的检测与鉴定导入检测：DNA分子杂交法(使用DNA探针)。,表达检测,转录检测：分子杂交法检测mRNA翻译检测：免疫法，提取蛋白质用相应的抗体进行抗体抗原杂交,个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。,切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。,3基因工程的应用(1)乳腺生物反应器与微生物生产的比较,乳腺生物反应器受生物性别的限制，若从动物尿液中提取目的基因产物则不受性别限制。,(2)基因治疗,转移,(2010温州质检)下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列和切割的位点。如下图，已知某DNA在目的基因的两端1、2、3、4四处有BamHI或EcoRI或PstI的酶切位点。现用BamHI和EcoRI两种酶同时切割该DNA片段(假设所用的酶均可将识别位点完全切开)，下列各种酶切位点情况中，可以防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状的是(),1.,A1为BamH，2为EcoR，3为BamH，4为PstB1为EcoR，2为BamH，3为BamH，4为PstC1为Pst，2为EcoR，3为EcoR，4为BamHD1为BamH，2为EcoR，3为Pst，4为EcoR,解析：只用BamH和EcoR两种酶同时切割该DNA片段，要想防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，只要目的基因两端2与3的限制酶为BamH或EcoR即可。,答案：A,2.下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。,(1)图中基因工程的基本过程可以概括为“四步曲”：即；。(2)能否利用人的皮肤细胞来完成过程？，为什么？。(3)过程必需的酶是酶，过程必需的酶是酶。(4)若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，是过程连续进行4次，至少需提供胸腺嘧啶个。,(5)在利用AB获得C的过程中，必须用切割A和B，使它们产生，再加入，才可形成C。(6)为使过程更易进行，可用(药剂)处理D。,解析：图中过程是从细胞中获取相应的mRNA，由于基因的选择性表达，人的皮肤细胞中的胰岛素基因不表达，不转录，因此不能形成胰岛素mRNA。从mRNADNA是逆转录的过程，需要逆转录酶。DNA分子的扩增须用解旋酶将双链DNA解旋为单链。一个DNA分子中的鸟嘌呤(b个)和胸腺嘧啶之和占碱基总数(2a个)的一半，所以该一个DNA分子片段中胸腺嘧啶数为(ab)个。连续复制4次，共产生DNA分子2416个，由于复制方式为半保留复制，故需要提供的胸腺嘧啶数量为(ab)(161)15(ab)。构建基因表达载体时需,将目的基因与运载体用同一种限制酶切割，产生相同的黏性末端，才可以在DNA连接酶的作用下连接形成基因表达载体。将目的基因导入细菌，常用Ca2处理细菌，使其变为感受态细菌，可吸收含目的基因的运载体进入细菌细胞内。,答案：(1)获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定(2)不能皮肤细胞中的胰岛素基因未表达(或未转录)，不能形成胰岛素mRNA(3)逆转录解旋(4)15(ab)(5)同一种限制核酸性内切酶相同的黏性末端DNA连接酶(6)CaCl2(或答Ca2),由于密码子具有“简并性”，故由某种特定氨基酸序列所推测出的脱氧核苷酸序列可有多种，即逆推所得的基因可有多种。,下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达,解析目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；基因工程中常用的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶；大肠杆菌为原核生物，不含有内质网和高尔基体等细胞器，不能对蛋白质进行加工，其合成的胰岛素原无生物活性。载体中的抗性基因为标记基因，其作用是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。,答案D,苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。,(1)将图中的DNA用Hind、BamH完全酶切后，反应管中有_种DNA片段。(2)图中表示Hind与BamH酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_种重组质粒；如果换用Bst与BamH酶切，目的基因与质粒连接后可获得_种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后，不能影响质粒的_。,(4)图中的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的TDNA导入植物细胞，并防止植物细胞中_对TDNA的降解。(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞_。(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的_基因频率的增长速率。,解析(1)BamH在中有2个切点，Hind在中有1个切点，故可切出4种DNA片段。(2)因Hind切出的末端与BamH切出的末端不同，则重组的质粒有2种。(3)质粒进入宿主细胞必须能正常复制才能为目的基因的扩增提供必要的条件。(4)植物细胞中有能降解TDNA的酶(DNA水解酶)。(5)不同生物的基因不同，表达产物的蛋白质也不同。从而造成人类肠上皮细胞表面无相应毒素蛋白的受体。(6)转基因与非转基因作物混种，可降低抗性作物对害虫的选择性，使害虫种群中的抗性基因频率增长速率减慢。,答案(1)4(2)21(3)复制(4)DNA水解酶(5)表面无相应的特异性受体(6)抗性,基因工程与蛋白质工程的理论基础(1)基因拼接的理论基础DNA是生物的主要遗传物质。DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(2)外源基因在受体内表达的理论基础基因是控制生物性状的独立遗传单位。遗传信息的传递都遵循中心法则的信息流动方向。生物界共用一套遗传密码。,天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：,(1)将淀粉酶基因切割下来所用的工具是_，用_将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子_，以完成工程菌的构建。,(2)若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是_；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用_检测；将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈。请解释该现象发生的原因。_。,(3)如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小？_。(4)微生物在基因工程领域中有哪些重要作用？_。,解析该工程菌的构建包括目的基因的获取，基因表达载体的构建和导入以及目的基因的检测与鉴定等步骤，相同条件下淀粉酶的活性或酒精产量可反映出该菌利用淀粉能力的大小。,答案(1)限制性核酸内切酶DNA连接酶导入酿酒酵母菌(2)DNA分子杂交抗原抗体杂交或淀粉酶活性该工程菌产生的淀粉酶可分泌至培养基，水解淀粉后的区域，遇碘不再变蓝色，产生透明圈(3)测定相同培养条件下不同工程菌菌株的淀粉酶活性或酒精产量(4)工具酶主要来自微生物；最重要的目的基因供体库之一；目的基因的载体之一；作为受体细胞；提供用于发酵的工程菌,(1)DNA在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度不同，其变化曲线为：(2)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的其他某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取含杂质较少的DNA。(3)DNA二苯胺蓝色(用于DNA的鉴定)。,沸水浴,(1)选鸡血作实验材料的原因鸡血经济且易制得，鸡血红细胞、白细胞都具有细胞核，含大量DNA。哺乳动物的红细胞没有细胞核，DNA含量较低，因而不宜作实验材料。,(2)制备鸡血细胞液的方法鸡血柠檬酸钠,用离心机离心，血细胞沉淀于底部放冰箱内静置，血细胞沉淀于底部,(3)实验中三次加NaCl溶液在步骤2中，加入NaCl溶液后必须充分搅拌，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在NaCl溶液中。在步骤5中，加NaCl溶液的目的是使DNA再溶解，这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加NaCl溶液的浓度比前两次低得多，但目的还是溶解DNA。,(4)实验中三次过滤步骤1中将鸡血细胞液进行过滤，取得的滤液中含有染色质，而滤出的是细胞膜、核膜和细胞器等的破碎结构。步骤4中过滤得到的是DNA黏稠物，而滤液中含有仍然溶解在NaCl溶液中的细胞中的一些成分，如蛋白质等。步骤6中过滤后的滤液中含有DNA。,(5)实验中两次使用蒸馏水第一次在第1步，目的是使鸡血细胞吸水涨破，加水后必须充分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分吸水破裂。第二次是在第3步，目的是稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出。,(6)实验中六次搅拌前5次搅拌均要求朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取各步中，搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。,关于“DNA的粗提取与鉴定”的实验装置如图：,(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血。主要原因是鸡血细胞液中_含量较高。(2)在上图A所示的实验步骤中加蒸馏水20mL的目的是_。通过图B所示的步骤取得滤液，再在滤液中加入2molL1NaCl溶液的目的是_，图C所示实验中加蒸馏水的目的是_。(3)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可滴加_溶液，结果丝状物被染成绿色。,解析(1)鸡血细胞中含较多的DNA，而血浆中不含DNA，因此实验材料应用鸡血细胞液而不用鸡全血。(2)要明确区别两次加蒸馏水的目的，第一次目的是让鸡血细胞吸水涨破，放出DNA，第二次加蒸馏水是为了降低NaCl溶液的浓度，使溶解于2molL1NaCl溶液中的DNA析出。(3)本题考查DNA的鉴定，可以加二苯胺沸水浴变蓝色，也可加甲基绿使DNA变绿色，本题干无沸水浴这一条件，且结果是丝状物变绿色，所以使用的试剂为甲基绿。,答案(1)DNA(2)使血细胞吸水涨破，放出DNA使滤液中的DNA溶于盐溶液使DNA析出(3)甲基绿,随堂高考1.(2008全国卷)已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是(),A.3B.4C.9D.12,解析：若该线性DNA分子在3个酶切位点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切位点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切位点切断，得到2种长度不同的DNA片段。因此最多能产生4329(种)长度不同的DNA片段。,答案：C,2(2008海南高考)下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoR、BamH的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因。tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。,据图回答：(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoR酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_、_、_三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_。,(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有_。(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是_。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。,解析：将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoR酶切所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物，这些连接物可采用电泳、层析或超速离心的等手段分离纯化，将这3种连接物导入受体菌后，可根据不同连接物所携带抗性基因的差异选择不同的选择培养基进行筛选。由图示和题目中提供的信息可知，同时应用EcoR和BamH进行酶切可有效防止酶切后产生末端发生任意连接。,答案：(1)目的基因载体连接物载体载体连接物目的基因目的基因连接物分离纯化(2)载体载体连接物目的基因载体连接物、载体载体连接物(3)启动子mRNA(4)EcoR和BamH(只答一种酶不给分),3.(2008江苏高考)将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。,表1引物对序列表,表2几种限制酶识别序列及切割位点表,请根据以上图表回答下列问题。(1)在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。(2)PCR过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？。,(3)图1步骤所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。(4)为将外源基因转入马铃薯，图1步骤转基因所用的细菌B通常为。(5)对符合设计要求的重组质粒T进行酶切。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用EcoR和Pst酶切，得到种DNA片段。采用EcoR和Sma酶切得到种DNA片段。,解析：(1)PCR技术扩增DNA时，首先要在80100温度范围内使DNA解螺旋。高温解决了打开DNA双链问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。20世纪80年代，科学家从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶，使体外DNA扩增成为现实。,(2)碱基A与T之间是依靠两个氢键相连配对，碱基C与G之间是通过3个氢键相连配对，DNA分子中碱基C与G的比例决定了DNA分子的耐高温的程度。引物对B中C与G的比例明显高于引物对A，因此，引物对B可采用较高的退火温度。(3)DNA连接酶的作用部位是磷酸基团与五碳糖之间的磷酸二酯键，自然，对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。,(4)将外源基因导入不同受体细胞时，所用的方法是不同的。对于动物细胞常用显微注射法，对于植物细胞最常用农杆菌转化法。故本小题所用的细菌B通常为农杆菌。(5)由图1过程知，用EcoR酶和Alu酶切割抗原基因DNA片段会得到XY片段，由图1过程可知，用EcoR酶和Sma酶切割质粒产生MN片段。这样形成的两个DNA片段用DNA连接酶形成重组质粒。其中X、M连接处是EcoR酶切割位点，M、N之间还有一个Pst酶切割位点。如果用EcoR酶和Pst酶切割重组质粒，将会在两个切割位点切割产生2种DNA片段。但若用EcoR和SmaI酶切割重组质粒，由于只有一个切割位点(由图1过程判断)，故只产生1种DNA片段。,答案：(1)耐高温(2)引物对B(3)否(4)农杆菌(5)21,4(2009福建高考)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有PstI、SmaI、EcoRI、ApaI等四种限制酶切割位点。请回答：,(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶_，对_进行切割。(2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有_，作为标记基因。(3)香蕉组织细胞具有_，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中、依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的_。,解析：(1)由于限制酶SmaI的切割位点在抗病基因的中间，因此不能用限制酶SmaI来进行切割目的基因。要将目的基因从含抗病基因的DNA分子中切割下来，从图中看需要用限制酶PstI和EcoRI同时进行切割。而运载体要和目的基因含有相同的黏性末端才能进行连接，所以质粒也要用限制酶PstI和EcoRI进行切割。(2)由于卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，所以构建的基因表达载体A中应含抗卡那霉素基因，作为标记基因。(3)由于香蕉组织细胞具有全能性，因此利用植物组织培养技术可将导入