TBK1-IRF3信号通路.ppt

dsDNA使用TBK1-IRF3信号通路与ZBP-1,2,1.DsDNA使用TBK1-IRF3信号通路,IRF作为转录因子不仅仅在许多细胞类型中调控IFN的表达,更是一类重要的多功的转录因子。IRF-3在非感染细胞中存在于胞质中,在胞质中不与其他蛋白质结合，以单体非活化形式存在。一旦受到上游信号转的刺激，IRF-3被磷酸化激活，分子内部的自我抑制域被打开，形成同二聚体或与IRF-7形成异二聚体后进入细胞核，与共同活化因子CBP/p300结合发挥转录活性。磷酸化后的IRF-3与b-干扰素启动子结合，可显著增高病毒介导的I型IFN的表达。IRF-3磷酸化受多条信号转导通路及相关分子的调控。病毒入侵后,模式识别受体通过识别病原相关分子模式，经线粒体抗病毒信号传送蛋白(MAVS)等接头蛋白传递信号，激活下游激酶复合体(如IKK-IKKa-IKK和TBK1/IKK)，通过不同机制活化转录因子IRF-3，引起I型IFN及抗病毒细胞因子表达，IFN进一步激活IFN信号通路,刺激数百个IFN刺激基因（ISG)表达,并由ISG启动抗病毒效应。在病毒感染的早期，组成型表达的IRF-3被磷酸化后入核,激活IFN-的少量表达，IFN-结合型IFN受体(IFNR)，通过干扰素刺激基因因子3(ISGF3)复合体结合在IRF-7启动子上诱导其大量表达;在感染的晚期IRF-7被磷酸化入核，诱导IFN-、IFN-的大量表达，从而激活抗病毒基因的表达，起到抗病毒的作用。,3,5/11/2020,(1)免疫刺激效应只限于B型dsDNA,在我们对DNA免疫刺激效应理解上的下一步飞跃始于意识到当被直接导入细胞质时非病原菌来源的DNA也是有免疫刺激性的。在我们实验室的调查中揭示dsDNA，当用胞质转染法转染时是一个IFN-和趋化因子基因如Cxd10,Cd5和Cd2潜在的诱导物在小鼠和人的树突细胞以及间质细胞。关于免疫原性的条件在添加的CpGDNA和转染的dsDNA之间是不同的。如果不考虑这些序列，胞质dsDNA仍然是有刺激性的并且可以诱导IFN-即使当它是甲基化的。这不只限于病原来源的DNA，因为当转染时那些缺乏CpG岛的小牛胸腺和人造DNA和E.coli以及HSV-1有相同的刺激性。此外，之前被证明由于缺乏TLR9表达而对CpG无反应的小鼠胚胎成纤维细胞当用DNA转染时表现出IFN-的诱导效应。这种dsDNA的IFN-刺激效应依赖于它的长度。长的dsDNA诱导更强的IFN-反应。只有dsDNA是有刺激性的；ssDNA如互补DNA(cDNA)被发现是免疫惰性的。这种刺激效应也只限于B型（B-DNA）的dsDNA而非Z型(Z-DNA)构象。B-DNA是一种dsDNA结构普遍出现的低能状态采用右手螺旋构象。相反，Z-DNA采用高能的左手螺旋结构在生理状态下出现较少。人造由AT重复聚（dAdT）.聚（dTdA）(聚（dA.dT）将来)dsDNA倾向于采用B型构象并且当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时可以诱导潜在的IFN-反应。另一方面，由GC重复组成的人造dsDNA，聚（dG-dC）聚（dC-dG）聚（dG-dC）将来），采用Z型构象，当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时没有刺激性。,5/11/2020,(2)TBK1-IRF3信号轴对于由胞浆B-DNA刺激诱导IFN-是至关重要的,我们把我们的注意力转向TBK1，之前发现对于在感染期间通过病毒的dsRNA诱导IFN-是必需的。TBK1是非经典的IB激酶和IKK以及IKK相关，是NF-B活化的调节者。它在NF-B活动和IFN-反应中起中介作用由TLR依赖和非依赖途径触发。TBK1也已证明对于当用CpGDNA刺激时类胞浆树突状细胞产生IFN-是非必需的。和那个观察形成对比，我们表明IFN和其他的由B-DNA转染诱导的趋化因子反应在TBK1-/-小鼠胚胎成纤维细胞是完全没有的。TBK1对于IRF3的二聚化是必须的，由B-DNA所诱导，但B-DNA诱导NF-B激活是多余的。因此TBK1-IRF3信号轴对于由胞浆B-DNA刺激诱导IFN-是至关重要的。,5/11/2020,(3)大多数的上调基因是干扰素诱导基因也是抗病毒相关基因,大多数的上调基因是干扰素诱导基因也是抗病毒相关基因如MX1和QASL2。因为这个原因，当用dsDNA预培养时，WTMEFs,而非TBK1-/-MEFs，能更好地免受水疱口炎病毒的威胁。除了越来越多的抗病毒反应外，TBK1依赖的通过DNA诱导IFN-的反应也被发现对DNA疫苗的功效至关重要。缺乏TBK1的小鼠不能诱导抗原特异性的CD4和CD8T细胞以及产生IFN脾细胞的增加频率，当用流行性感冒病毒DNA免疫时。,5/11/2020,(4)TBK1和IKK,TBK1和IKK激酶的激活触发了一连串的信号通过转录因子包括IRF的成员及标准的NF-B家族的磷酸化。最近的发现表明TBK1和IKK在细胞中RAS诱导的转化中起作用。TBK1由RalB-Sec5效应物复合物募集和激活，这对RAS起中介作用的转化是必需的。TBK1对于抑制细胞凋亡是必需的在应答RAS激活时，可能通过参与v-akt小鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物（AKT）存活途径。相似的，IKK也被鉴定为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT通路的效应器，和MAP激酶-ERK激酶（MEK）合作去促进转化。通过siRNA抑制增值，黏附和一些肿瘤细胞系侵袭可以损害IKK表达。在前列腺癌疾病模型中，观察到IKK表达水平和恶性肿瘤存在相关。,5/11/2020,5/11/2020,2鉴定内源DNA感受器,当TLR9非依赖途径被发现以后，DNA诱导炎症的TBK1-IRF3依赖通路，有一系列的报导鉴定识别dsDNA的胞内受体的文章发表。现在已知细胞检测DNA导致炎症反应不是存在于TLR9和病原来源DNA中CpG岛之间的直接对话。随着dsDNA能够诱导TLR9非依赖性的IFN-反应，大量的非细胞膜联系的胞内dsDNA检测器被鉴定。除了AIM2和Ku70以外，诱导的炎性反应共同鉴定的DNA感受器迄今为止是通过TBK1-IRF3信号轴诱导IFN-。通过KU70诱导IFN-产生，然而AIM2炎性体激活导致IL-1和IL-18的产生。我们将会重点用早期做出这个发现的文章分别描述鉴定的胞内DNA感受器。,5/11/2020,3Z-DNA结合蛋白-1（ZBP-1）,ZBP-1，也被认为是DNA依赖的干扰素调节因子（DAI）和DLM-1的激活物，是继TLR9之后最早被发现的胞浆DNA感受器。在被发现是胞浆DNA感受器之前，ZBP-1被认为在调节mRNA代谢中起作用并且作为肿瘤相关的蛋白参与主体对抗细胞压力反应。这是一个IFN-可诱导的基因产物最初被报道通过两个结合域结合Z-DNA。,5/11/2020,(1)ZBP-1对检测DNA是特异性的并且不参与RNA诱导的IFN-反应,由于通过检测DNA在诱导IFN-所起的作用，ZBP-1被发现参与DNA介导的抗病毒反应。提前用胞浆dsDNA刺激的ZBP-1缺陷的L929细胞被发现和WT细胞相比对脑心肌炎病毒感染抵抗力弱。此外，IFN的表达被表明在感染了单纯疱疹病毒-1（HSV-1）而非鸡新城疫病毒（NDV）的ZBP-1缺陷细胞中下调，这两种病毒分别是DNA和RNA病毒。和这个观察平行，ZBP-1缺陷的L929细胞和WTL929细胞相比产生高的HSV-1病毒滴定度，然而WT和ZBP-1-/-L929细胞对于NDV病毒的滴定度仍然相同。接下来，为了证明ZBP-1是DNA的受体，使用荧光共振能量转移（FRET）分析和免疫共沉淀分析表明它和B-DNA直接相互作用。显微镜检查试验表明ZBP-1主要位于细胞质内。,5/11/2020,(2)ZBP-1利用TBK1-IRF3信号通路诱导IFN-产生,它被表明在B-DNA刺激后诱导IRF3的二聚化。此外，TBK1和IRF3被证明和ZBP-1有生理上的联系，当用B-DNA刺激并用免疫共沉淀分析后。当ZBP-1,IRF3和TBK1之间的这种联系发生时，ZBP-1需要在丝氨酸352和353位置磷酸化。ZBP-1也可以通过B-DNA诱导介导NF-B激活。详细的试验揭示ZBP-1包含两个受体相互作用蛋白（RIP）同型结构域（RHIMs）这可以募集含RHIM激酶受体蛋白激酶1和3（RIP1和RIP3）激活NF-B。RIP3和RIP1是两个蛋白，之前被鉴定对通过TLR3信号调节NF-B至关重要。,5/11/2020,（3）ZBP-1死亡或难以死亡,ZBP-1在检测和诱发DNA刺激的炎性反应和对抗病原的免疫在这个发现在之后的报道中受到了质疑。早期设计的研究ZBP-1和通过DNA诱导IFN-的实验都是在ZBP-1沉默的L929细胞上操作的。然而当用MEF细胞替代时从这些实验获得的数据不能再现。此外，有其他的报导证明当用dsDNA转染或者用嗜肺军团菌感染人类细胞系HEK293和A549诱导IFN-和IL-8时ZBP-1是不需要的。也有报导证明它不参与肺炎双球菌和单纯疱疹病毒1感染诱导IFN-。我们也表明ZBP1-/-小鼠和WT小鼠有着相同水平的抗体和T细胞应答，当用DNA疫苗免疫时，不像TBK1缺陷型小鼠对DNA预防接种