SRY基因在性别鉴定中的应用.ppt

1,遗传学实验,SRY基因检测及在性别鉴定中的应用,2,二、实验目的,了解SRY基因检测及在性别鉴定中的应用,3,二、实验原理,性别的发育起始于胚胎第6周，胚胎的初期是属于中性的。所有的早期胚胎內都存在着两种性腺，外胚胎内存在两套导管，发育成女性的前身苗氏管（Mllerianducts）发育成男性的前身沃氏管（Wolffianducts）,4,SRY基因（sex-relatedY）,SRY基因（sex-relatedY）是人类性别决定基因，定位于Yp11.3.只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。该蛋白的功能是与DNA结合激活抗中肾旁管物质（MIS苗氏管抑制物质）调节途径，导致MIS表达，使前身苗氏管退化，女性生殖系统不能生成，生成睾酮，通过双氢睾酮作用，使胚胎体內的男性的前身沃氏管（Wolffianducts）发育，生成男性生殖系统。,5,PCR技术原理,PCR技术是一种体外核酸扩增系统，根据SRY的序列，合成特异引物，经PCR扩增仪的变性、退火和延伸三个步骤的多次循环，形成与模板链互补的新DNA链，产物长度300bp左右。,6,Yp11.3,7,基因组DNA的提取,磁珠法提取DNA,碱裂解法提取DNA,1.用NaOH作用20分钟2.加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。,1.裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶2.基因组DNA选择性吸附于磁珠3.通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，去除细胞代谢物、蛋白等杂质4.用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱,磁珠法提取DNA试剂盒磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。快速简捷，一般可在36分钟内完成。不用多次漂洗磁珠也可确保高纯度，提取出的基因组DNAOD260/OD280典型的比值达1.7-1.9，长度可达20kb-50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。,8,新鲜植物、动物组织，高温干燥过DNA破坏比较严重的植物、动物组织，海洋生物，法医鉴定，新鲜哺乳动物血液或干血点，转基因食品,9,1.样品处理,a.3根含毛囊的毛发向1.5ml离心管加入380lBufferMGL和20lProteinaseK，从毛发根部取1cm长的含毛囊的毛发加入上述离心管中。b.口腔脱落的细胞2ml唾液或10ml漱口水，2000rpm离心5min,将上清用移液器小心移去，向沉淀加入380lBufferMGL和20lProteinaseK。,10,2.将上述离心管振荡混匀，65水浴20min，间或混匀，使样品充分裂解。3.向充分裂解的样品加入400lBufferMA和10lMagicmagbeads,振荡混匀10s.(吸取Magicmagbeads之前，先混匀。务必将Magicmagbeads加至液面以下）4.将离心管置于磁力架上，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。(吸弃上清时，不要吸入Magicmagbeads）,11,5.加入700l70%乙醇，振荡混匀10s.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。6.重复步骤5，室温开盖干燥15min至管内无残液。7.加入15-25lTEBuffer,65水浴20min，间或混匀,离心2min，8.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸取上清至新的离心管，即获得jiyinzuDNA.,12,磁珠法提取DNA,13,14,15,基因组DNA的提取,碱裂解法提取DNA,1.用NaOH作用20分钟2.加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。,1、毛发样品DNA的制备（1）男生毛发10根，女生毛发10根作为对照。也可取一些口腔上皮细胞。（2）在一个200ulPCR管中加20l的0.2mol/LNaOH溶液。剪下带毛囊的发根部分，放入管中并盖上管盖，放入有热盖的PCR仪中，75温育30min，以避免水分蒸发。如使用牙签刮取口腔上皮细胞，应注意沾过NaOH溶液的牙签不能再放回口腔，以免烧伤。（3）加入50l的0.04mol/LHCl中和。（4）12000r/min离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶液中。,2、PCR反应（1）扩增人的SRY基因，所用引物为：SRY1:5-TGGGACTGGTGACAATTGTC-3SRY2：5-GAGTACAGGTGTGCAGCTCT-3,（2）每个样品反应体系为25l。首先将下列成分预混：10PCR缓冲液5l25mMMgCl24l2.5mmol/LdNTP4l10umol/LSRY引物12l10umol/LSRY引物22l1U/lTaq酶溶液1lddH2O26l共44ul。将上述成分混合均匀；分装到2只0.2ml离心管中（22l/管）；一管加入3l男生DNA，另一管加入3l女生DNA。,（3）PCR反应条件为：943min9430s5030s循环35次