PCR基因扩增仪.ppt

PCR基因扩增仪(PCRGeneAmplifier)环境科学与工程余晓玲,内容提要,1.PCR基因扩增仪的工作原理PCR技术的原理及发展PCR基因扩增仪的工作原理2.PCR扩增仪的分类与结构定性PCR扩增仪实时荧光定量PCR扩增仪3.PCR扩增仪的性能指标、操作规程PCR扩增仪的性能指标PCR扩增仪的操作规程4.PCR扩增仪的应用,第一节PCR基因扩增仪的工作原理,一、PCR技术的发展Khorana(1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”1985年，KaryMullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。,聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。,第一节PCR基因扩增仪的工作原理,二、PCR技术的原理体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复“变性退火引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。简单的说，PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。,第一节PCR基因扩增仪的工作原理,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,DNA模板与引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍,第一节PCR基因扩增仪的工作原理,PCR基因扩增仪的工作关键DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。,第一节PCR基因扩增仪的工作原理,第二节PCR扩增仪的分类与结构,第二节PCR扩增仪的分类与结构,荧光实时定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,第二节PCR扩增仪的分类与结构,第二节PCR扩增仪的分类与结构,金属板式实时定量PCR仪可作为普通PCR仪使用可带梯度功能可容纳的样本量大，无需特殊耗材温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致,第二节PCR扩增仪的分类与结构,ABI7500荧光定量PCR仪,MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪,Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪,第二节PCR扩增仪的分类与结构,离心式实时定量PCR仪温度均一性较好使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能,第二节PCR扩增仪的分类与结构,Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪,LightCycleTM荧光定量PCR仪,第二节PCR扩增仪的分类与结构,各孔独立控温的定量PCR仪不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。SmartCycler的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。SmartCycler上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。,第二节PCR扩增仪的分类与结构,SmartCycler荧光定量PCR仪,第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除,一、PCR扩增仪的性能指标,（二）荧光检测系统,激发光源,检测器,发光二极管,卤钨灯光源,超低温CCD,光电倍增管,第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程,（三）软件简便的人性化设计最能满足其需求。新型的PCR仪很注重程序编写的简易性，易学易用具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能，很多还可以免费升级。,（四）其他多样化样品基座设计、热盖等都使PCR仪越来越人性化。,第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程,第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程,二、PCR扩增仪的操作规程普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本