分子生物学ppt课件

第七章分子生物学技术简介,生物化学教研室,掌握聚合酶链反应的原理及反应组分。熟悉限制性核酸内切酶分析的原理及在多态性检测中的应用；核酸分离纯化的主要方法和步骤。了解人类基因组计划和生物芯片技术。,学习目标,生物学：研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的学科。现已在整体水平、细胞水平和分子水平三个层次上研究生命活动及其规律。分子生物学：是从分子水平上研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的学科。医学分子生物学：是从分子水平上研究人体和疾病相关生物在正常和疾病状况下生命活动及其规律、从分子水平上开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的学科。,现代分子生物学研究主要涉及三个领域,1.从核酸和蛋白质的结构与功能、基因组的结构与功能到基因的复制、表达、调控极其生物学效应；2.从生物大分子间的相互作用到这些相互作用构成的细胞间通讯和细胞内信号转导；3.从基因的结构、功能、表达调控的分析到基因的制备、改造、调控、应用所需的各种技术体系。,医学分子生物学的研究,主要在两个方面：1.进行基因与基因组结构与功能研究因为只有对正常基因、变异基因、外源基因、疾病易感基因的功能有了详细了解，才能从本质上解释疾病的发病机制。2.进行细胞间通讯和信号转导机制的研究因为细胞间通讯和细胞内信号转导是体内细胞功能、调控的分子基础，多种疾病的发生常常与某些信号分子的结构与功能改变有关。,医学分子生物学的应用,1.应用基因诊断和基因治疗对某些疾病进行诊断和治疗；2.用基因分析来确定病因；3.通过对基因功能研究和应用基因克隆与表达技术研制新型疫苗和新型药物。,一、研究进展现代分子生物学实验的基础主要包括分子克隆、体外DNA扩增技术、DNA测序以及核酸分子杂交技术。1970年，Smith等人发现了限制性内切酶，这种酶类的发现为核酸的研究提供了有用的工具。也为基因工程提供了条件。为此Smith等人也获得诺贝尔奖。基因工程技术的出现，标志着人类深入认识生命本质并能改造生命的新时期的开始。,第一节分子生物学检验技术,DNA序列测定方法的建立英国剑桥大学分子生物学实验室Sanger教授1975年建立了DNA测序方法，1980年获得诺贝尔奖。20世纪80年代的中期，Mullis等人发明PCR技术，引发了分子生物学的方法学革命。并衍生出定量PCR、原位PCR、RT-PCR等技术。20世纪90年代中期，生物芯片技术的诞生，及双向电泳、生物质谱等技术的运用，必将推动21世纪分子生物学研究的发展。,二、人类基因组概念基因组(Genome)：生物体一套完整遗传物质的总和。人类基因组包括23对染色体，即22对常染色体及一对性染色体（XX或XY）DNA的总和。基因（Gene）：一个功能性遗传单位。一个基因不仅包括编码蛋白质的序列，还包括调控序列，5端不翻译序列，内含子，及3端非编码序列。,基因组学（Genomics）：1986年由美国遗传学家罗德里克（T.H.Roderick）提出来的，以适应新学科的发展。目前，基因组学又分为结构基因组学及功能基因组学。结构基因组学就是对基因组进行作图和测序。功能基因组学是对已经知道的序列进行功能研究。,人类基因组结构总长约3109bp，包含约34万个基因，分散在23条染色体上。如果接成直线的话，长约1.02M，其中编码蛋白质的结构基因仅占2%3%，按每个基因在基因组出现的频率分为单拷贝顺序及重复顺序。细菌的基因组以E.Coli为例,DNA总长为4106bp，包含4000个基因，基因组是一条染色体，双链闭环DNA。病毒核酸大小不一（3kb300kb）。,人类基因组计划（HumanGeneticProject）,一、HGP的提出1986年，美国生物学家诺贝尔奖获得者杜泊克（Delbecco）在“Science”发表题为“癌症研究的转折点人类基因组全序列分析”。他提出人类疾病包括癌症在内直接或间接与基因有关，应该从整体研究基因组。他首先提出HGP概念。他写道“这样的工作任何一个实验室也难以承担的，它应该成为国际性的项目，人类的DNA序列是人类真諦”。,二、HPG研究的内容（一）遗传图又称连锁图（linkagemap），它以遗传多态性为“路标”,以遗传学距离厘摩（cM，centrimorgan）为图距的基因组作图。遗传多态性即在1个遗传位点上具有两个以上的等位基因，在群体中出现频率高于1%的称遗传多态性。厘摩是在减数分裂事件中，两个位点之间进行交换、重组的百分率。1%的重组率称1cM。1cM=1000kb.,1988年美国能源部和国家卫生研究院先成立了“人类基因组研究中心”请冷泉港研究所所长，沃森（Watson）教授担任第一任中心主任。1990年美国国会批准HGP计划，预计30亿美元，15年完成。随后几个发达国家也相继宣布HGP计划。1994年美、日、德、法、英五国联合正式启动这一计划。中国于1999年9月在英国伦敦举行的第五次人类基因组会议上正式加入该计划。,2001年2月15日在”Nature”上发表了人类基因组成果。1.人类基因组共有2.91Gbp。大约有34万个蛋白质编码区，只有2%的基因编码蛋白质。2.人类基因组基因分布不均匀。部分基因密集，如19号染色体；部分区域基因贫瘠，如13号染色体。3.人类基因组中35.3%包含重复顺序。其功能尚待研究。4.人类基因99.8%是相同的。0.2%有差异，种族之间无明显差异。,5.男、女差别。男性基因突变率是女性2倍，大部分遗传疾病基因在Y染色体上。6.插入基因约有200多个是来至于细菌的基因。可能是在人类的免疫系统建立之前，寄生于人类身体中的细菌与人类基因交换的结果。7.蛋白质组的复杂性。人类的进化不仅靠产生的蛋白质，更重要靠重排已有的蛋白质，实现蛋白质的种类和功能的多样性。,HGP研究的意义：1.在人类历史上，100多年前HenryGray绘制了完整的人体解剖图，奠定了现代医学的基础，HGP从分子水平上给人类画了第二张解剖图，揭开了人类生、老、病、死的遗传信息。2.在医学领域，推动了医学的发展，对疾病的发生、发展、诊断、预防提出了全新的概念。3.推动了生物界的革命，随着人类基因组的破译，许多生物的基因组相继被揭开，如果蝇、水稻、小鼠、大鼠等。,中国在人类基因组研究中的作用：我国人类基因组的研究在1994年开始启动，以“中国人类遗传多样性”的研究作为重点，我国有56个民族和许多遗传隔离群，这对中国和世界都是一个重要的贡献1999年9月我国参与了世界人类基因组大会，接受了完成第3号染色体短臂的序列分析。2001年8月26日通过了人类基因组验收，完成了3000万bp的测序工作，准确率99.99%。,目前核酸的分离纯化主要包括4个步骤1.制备细胞及破碎细胞；2.消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂质等大分子；3.去除其他不需要的核酸分子；4.沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。,第二节核酸的分离制备,一、DNA的分离纯化DNA是遗传信息的载体，是分子生物学研究的主要对象，因此，DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。在DNA提取过程中应做到：1.根据不同研究需要，保证结构的相对完整性；2.尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；3.保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。,（一）基因组总DNA的分离与纯化基本过程为粉碎动植物组织，裂解细胞，有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。1.样本制备生物组织；培养细胞；血液。2.DNA提取提取方法主要有氯仿法、去污法和酚抽提法。主要利用核酸与蛋白质对酚和氯仿变性作用的反应不同以分离核酸和蛋白质。（SDS、蛋白酶K消化蛋白质，EDTA抑制DNA酶）,二、RNA的分离与纯化RNA的提取过程中的五个关键点：1.样品细胞或组织的破碎；2.有效地使核蛋白复合体变性；3.对内源RNA酶的抑制；4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。,RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：1.提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2.直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。,（一）总RNA的提取总RNA纯化系统采用两种RNA酶抑制剂，异硫氰酸胍(GTC)和-巯基乙醇，整个操作在冰浴下进行，能显著降低RNA的降解速率。采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低pH值的酚将使RNA进入水相，与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA用异丙醇沉淀浓缩。将RNA沉淀复溶于GTC溶液中，用异丙醇进行二次沉淀，用乙醇洗涤沉淀，即可去除残留的蛋白质和无机盐。,（二）mRNA的分离与纯化mRNA分子最显著的结构特征是具有5帽子结构（m7G）和3端的poly（A）尾巴。通常以寡聚（dT）-纤维素拄层析或poly（U）琼脂糖拄的亲和层析发最为常用。,限制性核酸内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸酶。类：具修饰与切割双链DNA功能，但切割位点是随机的，无大作用。类：能识别和切割双链DNA的特异顺序，产生特异DNA片段，在重组DNA中具有重要价值。类：具修饰和切割双链DNA功能，能在识别位点附近切割DNA，但切割位点难预测，该类酶亦无大作用。,第三节限制性核酸内切酶酶切分析,一、PCR的基本原理PCR(Polymerasechainreaction)中文叫聚合酶链反应，是DNA体外扩增技术，它可以在几小时内将任何微量DNA特异性地扩增成千上万倍。DNA高温变性成为单链再在低温下引物与单链DNA退火在DNA聚合酶作用下，合成一条与单链DNA互补的新DNA链这一变性、退火与引物延伸作为一个循环，进行2040次。,第四节聚合酶链反应,PCR原理示意图,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,1.TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶能以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将4种脱氧核苷酸以碱基配对方式，按53方向，合成新的DNA链。这种酶的最适温度为7075，酶量一般为13U/反应管，过高会引起非特异性产物的扩增。,二、PCR反应体系,2.寡核苷酸引物能与模板特异结合，引物设计的原则：引物长度，1530碱基。引物中碱基的分布是随机的。避免两引物间的互补。引物的碱基顺序不应与非扩增区互补。引物的3末端一定要与模板配对其浓度通常是0.11mol/L,3.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）dNTP稳定性好，使用浓度为20200mol/L，且四种脱氧核苷酸浓度要接近。使用时要用NaOH调pH值7.07.5再分装，不要过多冻融。高浓度核苷酸会增加聚合的错误和成本，低浓度会导致反应速度下降，但可提高实验的精确性。Mg2+可与dNTP结合，使游离Mg2+降低。要注意Mg2+浓度与dNTP浓度之间的关系。,4.PCR反应缓冲液Tris-Cl(pH8.38.8)，KCl(50mmol/L)，MgCl2(1.5mmol/L)，明胶(0.1%)和甲酰胺(5%)。其中Mg2+最为重要，其浓度可影响酶活性与精确度以及产物的特异性。体系的pH为8.38.8是因为70时反应体系的pH会下降一个多单位，而pH低于7.0会影响聚合酶的活性。KCl合适浓度能促进引物退火，但过高会抑制聚合酶活性。明胶主要用来稳定酶活性。甲酰胺主要用来加强反应的特异性。,5.模板DNA要求不严格，主要避免标本间的交叉污染，模板中不能有聚合酶抑制剂。6.PCR的循环数一般为30个循环，过少产物量不多，过多非特异性产物会增加，标准扩增条件是9430秒，5530秒，7230秒。,三、PCR技术在医学上的应用1.感染性疾病病原体的检测如结核杆菌2.遗传病相关基因的检测如镰刀性红细胞贫血，可设计一对引物把包含突变的DNA片段进行扩增，扩增产物用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：正常人有2个片段即191和103，镰刀细胞贫血的纯合子只有1个片段即294，杂合子有3个片段即191、103和294）。3.恶性肿瘤的诊断和研究举例说明（缺失片段包含设计的引物）,核酸分子杂交技术是利用DNA变性后具有互补序列的两条单链在一定条件下，可通过碱基配对原则，重新聚合形成双链的原理。包括DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA。,第五节分子杂交与生物芯片,一、分子杂交,（一）探针的概念和特征核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。1.要加以标记，带有示踪物。2.应是单链。3.具有高度特异性，只与靶核酸杂交。4.长度为十几到上千个bp。5.具有高灵敏度、稳定、标记方法简便。,（二）探针的种类及制备1.基因组DNA探针一般从基因文库中选取某一基因片段，将其与质粒或噬菌体载体连接，进行克隆后酶切获得，也可用PCR来制备。2.cDNA探针这种探针是以特定mRNA为模板，经反转录获得cDNA后，进行克隆，即可作为探针使用。与基因组DNA探针相比，cDNA探针不存在内含子及其它高度重复序列，是一种理想的核酸分子探针。,3.RNA探针通过基因克隆和转录可得到RNA探针。特点：杂交反应效率高，非特异性杂交少，可通过RNase来降低本底干扰。可以测定基因正向和反向转录水平。RNA探针易降解，标记复杂。4.寡核苷酸探针是人工合成的DNA探针，这类探针不如克隆探针好，如灵敏度较差，其优点是可大量合成且价格低，容易进行非放射性标记。,（三）探针的标记物1.放射性核素标记物优点：灵敏度高，在最适条件下，可检测小于1000个分子的核酸含量或1018g的物质。不影响酶促反应。不影响碱基配对的特异性和稳定性。缺点：易造成放射性污染。常用的有32P、3H、35S和125I、131I等。,2.非放射性核素标记物主要标记物有：生物素、地高辛、荧光素、酶等。特点：灵敏度较放射性核素标记的探针低，但具有稳定、安全、经济及实验周期短。,（四）标记方法1.酶标记法是指将标记物预先标记在单核苷酸分子上，然后利用酶促反应将它掺入到探针分子中或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。2.化学标记法是指利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生化学反应，从而将标记物直接结合到探针分子上。,DNase,EcoliDNApol,dATPdATPdGTPdCTPdTTP,切口平移法标记探针,35,53,53,53,35,35,dATPdATPdGTPdCTPdTTP,EcoliDNApol,随机引物,变性,随机引物法标记探针,变性,35,53,3,5,5,3,1.Southern印迹杂交：2.Northern印迹杂交：3.斑点杂交：4.原位杂交：,将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,Northern印迹杂交与Southern印迹杂交基本相似，但所检测的是RNA（主要是mRNA）。操作中不能被RNA酶污染，电泳时有变性剂，印迹前要将变性剂去掉。,Southern印迹杂交这是一种DNA/DNA杂交，是检测特异DNA的方法，将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。因Southern发明而得名。,斑点杂交将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点杂交。优点：简单、快速、在同一张膜上可同时检测多个样品。,（五）核酸分子杂交的基本方法,二、生物芯片,DNA芯片技术是近年来综合运用分子生物学、微电子学、微加工和计算机等多学科交叉融合而成的高新技术。在每平方厘米的芯片上可密集排列成千上万个生物分子，能快速、准确地检测核酸，获取样品中的有关信息。DNA芯片技术在基因测序、基因表达、基因突变及多态性检测、基因诊断和基因药物设计等方面有着广泛的应用。,（一）DNA芯片技术的概念基因芯片指对大量DNA片段同时进行处理、分析的技术，由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，故称为DNA芯片。基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。,（二）DNA芯片的主要类型从点阵的制备方法来分主要有两类：原位合成芯片与DNA微集阵列。1.原位合成型采用光介导和电打印等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。2.DNA微集阵列将预先制备的DNA片段用显微打印的方式有序地固定于支持物表面而制成的芯片称为DNA微集阵列，也称DNA微集芯片。,（1）光介导原位合成法首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部位不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光），以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。,优点：合成速度快，点阵密度高。缺点：设备昂贵，技术复杂，合成长度一般小于30bp,光介导寡聚核苷酸合成示意图,（2）压电打印合成法基本原理与普通彩色打印机相似，在墨盒中装入4种单核苷酸，在计算机控制下，通过喷嘴有序开放和关闭将单核苷酸喷射到预设的经包被的支持物表面。然后去保护、偶联、冲洗等步骤，进行寡聚核苷酸的延伸。,移动喷射,接触表面,移动喷头,重复,重复,输送液滴,喷墨打印法,针式打印法,微集阵列,微集阵列,（三）基因芯片的杂交检测1.样品的准备样品的准备包括样品的分离纯化，扩增和标记等过程。扩增：采用固相PCR系统，在靶DNA上设计一对双向引物，并固化在丙烯酰胺薄膜上，加入模板DNA及PCR试剂，在固相表面进行PCR反应。标记：主要采用荧光标记法，也可用生物素、放射性核素等标记。样品的标记在PCR